Étude de la signalisation TGF-β et de la transition épithéliale à mésenchymale induite par le TGF-β dans le cancer du sein et les cellules normales

Summary

Nous décrivons un workflow systématique pour étudier la signalisation de TGF-β et l’EMT TGF-β-induit en étudiant la protéine et l’expression de gène impliquées dans cette voie de signalisation. Les méthodes incluent le blotting occidental, un essai de journaliste de luciferase, qPCR, et la coloration d’immunofluorescence.

Abstract

La transformation du facteur de croissance β (TGF-β) est un facteur multifonctionnel sécrété qui joue un rôle clé dans la communication intercellulaire. Les perturbations du TGF-β signalisation peuvent mener au cancer du sein. TGF-β provoque ses effets sur la prolifération et la différenciation par l’intermédiaire de récepteurs spécifiques de type I et de type II de surface cellulaire TGF-β (c.-à-d. TβRI et TβRII) qui contiennent un domaine intrinsèque de kinase de sérine/thréonine. Sur la formation hétéromère hétéromérique induite par TGF-β, tβRI activé suscite la signalisation intracellulaire en phosphorylating SMAD2 et SMAD3. Ces SMAD activés forment des complexes hétéromériques avec SMAD4 pour réguler des gènes cibles spécifiques, y compris l’inhibiteur de l’activation du plasminogène 1 (PAI-1, codé par le gène SERPINE1). L’induction de la transition épithéliale-à-mésenchymale (EMT) permet aux cellules cancéreuses épithéliales au site primaire ou pendant la colonisation aux emplacements éloignés d’obtenir un phénotype envahissant et de conduire la progression de tumeur. TGF-β comme un puissant inducteur de l’invasion du cancer du sein en conduisant l’EMT. Ici, nous décrivons des méthodes systématiques pour étudier la signalisation de TGF-β et les réponses d’EMT utilisant les cellules mcf10A-RAS humaines prémalignes (M2) et les cellules épithéliales de souris de NMuMG comme exemples. Nous décrivons des méthodes pour déterminer la phosphorylation SMAD2 induite par TGF-β par blotting occidental, activité transcriptionnelle SMAD3/SMAD4-dépendante utilisant l’activité de journaliste de luciferase et l’expression cible de gène de SERPINE1 par réaction quantitative en chaîne de polymésexe en temps réel (qRT-PCR). En outre, des méthodes sont décrites pour examiner l’EMT TGF-β-induit en mesurant des changements dans la morphologie, l’expression épithéliale et mésenchymale de marqueur, la coloration filamenteuse d’actine et la coloration d’immunofluorescence de E-cadherin. Deux inhibiteurs sélectifs de la kinase des récepteurs TGF-β, GW788388 et SB431542, ont été utilisés pour bloquer la phosphorylation SMAD2 induite par le TGF-β, les gènes cibles et les changements dans l’expression des marqueurs EMT. En outre, nous décrivons la transdifferentiation du sein mésenchymal Py2T cellules épithéliales de tumeur en adipocytes. Les méthodes d’examen de la signalisation induite par β TGF et de l’EMT dans le cancer du sein peuvent contribuer à de nouvelles approches thérapeutiques pour le cancer du sein.

Introduction

Le cytokine transformant le facteur de croissance-β (TGF-β) est le prototype d’un grand groupe de polypeptides réglementaires structurellement et fonctionnellement liés, y compris les TGF-βs (c.-à-d. TGF-β1, -β2 et -β3), les protéines morphogéniques osseuses (PGB) et les activines^1,2. Ces cytokines jouent tous un rôle important dans le développement embryonnaire et dans le maintien de l’homéostasie tissulaire et^{organique 3}. La mauvaise réglementation du TGF-β peut conduire à une grande variété de maladies, y compris le cancer^4,5. TGF-β joue un rôle complexe et double dans la progression du cancer : dans les cellules épithéliales normales et prémalignes, TGF-β se comporte comme un suppresseur de tumeur en inhibant la prolifération et en induisant l’apoptose^6,7; toutefois, au stade avancé de la progression tumorale, lorsque les réponses cytostatiques sont bloquées par l’activation d’oncogènes ou la perte de gènes suppresseurs de tumeurs, TGF-β agit comme exhausteur de tumeur en favorisant la transition épithéliale à mésenchymale (EMT) dans les cellules cancéreuses, permettant ainsi l’invasion et la métastase de cellules cancéreuses, agissant sur des cellules dans le microenvironnement de tumeur, et stimulant l’angiogenèse et l’évasion^{immunisée 8,9,10.}

TGF-β est sécrète comme molécule précurseur inactive contenant le TGF-β à phase carboxy mature et le peptide associé à la latence (LAP)¹¹. Ce petit complexe peut être lié de façon covalente par la protéine latente TGF-β-liant (LTBP)¹². La libération de TGF-β matures peut être médiatione par l’action de protéases spécifiques qui fendent LAP ou par la traction mécanique de LAP dans un processus dépendant de l’intégrine^13,14. En plus de LTBP, glycoprotéine A répétitions prédominantes (GARP) est fortement exprimée à la surface des cellules T réglementaires (Tregs) et joue un rôle similaire que LTBP dans la régulation de l’activation de TGF-β^15,16. Garp se lie directement à la liaison latente TGF-β par le lien de disulfide et l’association noncovalente. L’activation du TGF-β du complexe GARP/TGF-β nécessite des intégrateurs¹⁷. Le TGF-β mature se lie aux récepteurs de la kinase TGF-β serine/threonine, c’est-à-dire les récepteurs TGF-β de type I (TβRI) et TGF-β de type II (TβRII)¹⁸ pour initier la signalisation. La liaison de TGF-β à TβRII favorise le recrutement de TβRI et la formation d’un complexe hétéromérique. Par la suite, TβRI est phosphorylated par kinase de TβRII sur des résidus de sérine et de thréonine dans un motif glycine- et serine-riche (GS) court, ayant pour résultat son activation^19,20. Lors de l’activation, tβRI activé recrute et phosphorylate ses substrats : les deux SMAD spécifiques aux récepteurs (R-SMAD) qui incluent SMAD2 et SMAD3 (Figure 1). Les R-SMAD partagent une structure globale similaire avec deux domaines dits d’homologie folle, MH1 et MH2, qui sont séparés par une région linker riche en proline (Figure 2). Le motif de liaison ADN dans le domaine MH1 de SMAD3 n’est pas conservé entre SMAD2 et SMAD3, et SMAD2 ne peut pas lier directement l’ADN en raison de deux insertions dans son domaine MH1 (exon 3 et L1). SMAD2 et SMAD3 peuvent être activés par la phosphorylation du motif SSXS dans leur C-termini (Figure 2). Phosphorylated SMAD2/3 forme des complexes hétéromériques avec un médiateur SMAD commun, SMAD4, qui se translocalise dans le noyau pour moduler la transcription des gènes cibles (Figure 1)^7,21. Cette voie canonique de signalisation de SMAD est précisément réglée et génère des réponses cellulaires et tissulaires spécifiques telles que la régulation du destin cellulaire et la métastase et l’invasion de cellules^{tumorales 22.} En plus de la signalisation TGF-β-SMAD, les voies de signalisation non SMAD peuvent également être activées directement par les récepteurs pour réguler les réponses cellulaires^{en aval 23}.

Pendant la progression de tumeur, l’activation des voies SMAD-dépendantes et SMAD-indépendantes induites par TGF-β sont nécessaires pour l’induction de l’EMT. L’EMT est un processus réversible dans lequel les cellules tumorales se dédifférencient d’un phénotype épithélial, qui est associé à la perte des contacts cellule-cellule et à la polarité apical-basale diminuée, à un phénotype mésenchymal avec la motilité accrue et la capacité d’invasion^24. L’EMT se caractérise par une augmentation de l’expression des protéines marqueurs mésenchymiques, y compris la N-cadhérine, la vimentine, zeb2 et l’escargot1/2, et la downregulation concomitante des marqueurs épithéliales, tels que e-cadhérine et β-caténine (figure 3)²⁵. Cependant, la transition d’un état épithélial à un état mésenchymal est souvent incomplète, et les cellules gagnent des caractéristiques épithéliales et mésenchymales mélangées (E/M). Un article récent de l’association internationale emt a proposé de décrire le processus des cellules subissant des états phénotypiques intermédiaires E/M comme plasticité épithéliale-mésenchymale (EMP)²⁶. Cette plasticité se réfère à l’EMT partiel, à un statut hybride E/M, à un état emt métastable, à un continuum EMT et à un spectre EMT²⁶. Pendant l’EMT, les cellules de tumeur gagnent des propriétés de cellules souches cancéreuses (CSC) et deviennent plus résistantes à l’apoptose^{détachement-induite 27.} Tandis que l’EMT est responsable de l’acquisition d’un phénotype invasif dans les cellules primaires de tumeur et conduit la progression de cancer, en revanche, la transition mésenchymal-épithéliale (MET) a été montrée pour jouer un rôle important dans l’excroissance des cellules de tumeur disséminées aux emplacements métastatiques^{éloignés 28,29.} Une étude récente a démontré que les cellules cancéreuses du sein dérivées de l’EMT peuvent être transdifférenciées en adipocytes, ce qui pourrait offrir une occasion d’inhiber la métastase et de surmonter la résistance thérapeutique dans les cellules tumorales et le cancer^{rechuté 30}. En raison du rôle important de la signalisation TGF-β dans l’activation de l’EMT dans la carcinogenèse du sein, nous présentons des protocoles détaillés pour le blotting occidental, un essai transcriptionnel de journaliste de luciferase, la réaction en chaîne quantitative en temps réel-polymétroase (qRT-PCR), et l’immunofluorescence pour l’investigation de la signalisation de TGF-β, de l’EMT TGF-β-induit, et de la transdifferentiation des cellules épithéliales de tumeur de sein murine emt-dérivées dans des adipocytes. Ces techniques sont les outils analytiques les plus couramment utilisés dans le domaine de la biologie cellulaire. qRT-PCR est utilisé pour détecter, caractériser et quantifier les niveaux d’expression de l’ARNm d’une manière quantitative. Comparé au PCR quantitatif (qPCR), une technique alternative, la transcription inverse (RT)-PCR peut être employée pour déterminer l’expression d’ARNm d’une manière semi-quantitative^31,32. Le ballonnement occidental est utilisé pour examiner des niveaux spécifiques de protéines dans un échantillon de lysate cellulaire donné avec des avantages de sensibilité et de spécificité, d’une manière semi-quantitative. Ainsi, nous présentons un flux de travail systématique pour analyser les changements de l’expression des gènes à l’expression des protéines pour aider à étudier la signalisation TGF-β qui peut également être appliquée à d’autres voies de signalisation.

Protocol

1. Analyse de la phosphorylation SMAD2 induite par β TGF à l’aide de ballonnements occidentaux NOTE : Les cellules mcf10A-Ras humaines prémalignes de sein ont été employées comme exemple pour étudier des réponses de signalisation de TGF-β33. En principe, les méthodes décrites ci-dessous s’appliquent également à d’autres lignées cellulaires β-sensibles au TGF. Culture de la lignée cellulaire épithéliale du sein MCF10A-Ras à 37 °C dans le milieu modifié de l’Aigle de Dulbecco (DMEM)/F12 contenant de la L-glutamine avec 5 % de sérum de cheval, 20 ng/mL facteur de croissance épidermique (EGF), 10 mg/mL d’insuline, 100 ng/mL d’entérotxine du choléra, 0,5 mg/mL d’hydrocortisone et 1/100 pénicilline-streptomycine (Pen-Strep). Essayez les cellules MCF10A-Ras avec 1 mL de trypsine-EDTA de 0,25 % pendant 1 minute et comptez les cellules viables à l’aide d’un compteur cellulaire. Cellules de graines dans des plaques de 6 puits à une densité de 5×105 cellules/puits. Après la croissance du jour au lendemain, traiter les cellules avec de l’albumine de sérum bovin sans TGF-β (5 ng/mL) ou ligand (4 mM HCl, 0,1% d’albumine de sérum bovin sans acides gras (BSA)) pendant 1 heure, puis enlever le milieu de culture et laver délicatement les cellules deux fois avec 1 mL de solution saline tamponnée de phosphate (PBS). Refroidir les cellules dans des plaques de 6 puits sur la glace et ajouter 150 μL de tampon de lyse de lyse radioimmunisé précoolé (RIPA) (150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, désoxycholate de sodium à 0,5 %, 0,1 % SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8,0 et mini cocktail inhibiteur de la protéase fraîchement ajouté). Laisser la lyse se poursuivre sur la glace pendant 10 minutes. Gratter les cellules adhérentes du plat à l’aide d’un grattoir à cellules en plastique, puis transférer délicatement la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse précoolé. Centrifugeuse la cellule lysate pendant 10 minutes à 150 force centrifuge (x g) à 4 °C et transférer le supernatant dans un tube de microcentrifugeuse frais de 1,5 mL. Mesurer la concentration en protéines à l’aide d’un kit d’analyse de protéines compatible avec le détergent (DC). Chargez 30 μg de protéines de chaque échantillon sur un gel électrophoresis de gel de sulfure de sulfate de dodecyl à 10 % de sodium (SDS-PAGE) et faites fonctionner le gel à une tension de 100 V pendant 1,5 à 2 heures. Transférer les protéines du gel à une membrane de difluoride polyvinylidene (PVDF) de 45 μm à une tension de 110 V pendant 1 à 1,5 heure. Transférer la membrane PVDF dans un récipient approprié avec le côté protéique (le côté qui faisait face au gel) vers le haut, et rincer brièvement la membrane dans de l’eau distillée. Jeter l’eau, ajouter ponceau solution S, et mettre la membrane sur une plate-forme de basculement pendant 1-2 minutes. Dé-tacher la membrane avec de l’eau distillée en la rinçant rapidement, puis en la lavant pendant 1 minute. Ensuite, mettez la membrane PVDF sur une boîte lumineuse, et prenez une photo pour vérifier les charges totales égales de protéines. Lavez la membrane avec de la solution saline tamponnée par Tris avec tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl et 0,1 % Tween 20) jusqu’à ce qu’il n’y ait pas de coloration visible. Mettez la membrane dans le tampon bloquant (5% de lait écrémé dans la solution TBST) et incubez-la pendant 1 heure à température ambiante. Laver la membrane deux fois avec tbst. Incuber la membrane avec des anticorps primaires contre le phospho-SMAD2 (p-SMAD2; 1:1000, fait maison 34),total SMAD2/3 1:1000 et glycéraldehyde 3-phosphate de déshydrogénase (GAPDH; 1:1000), nuit à 4 °C. Laver la membrane deux fois avec tbst et incuber la membrane avec un anticorps secondaire contre le lapin ou la souris (1:5000) pendant 2 heures. Incuber la membrane PVDF avec le substrat ECL occidental pendant 30 secondes, et détecter le signal à l’aide d’un système d’imagerie. Répétez les expériences au moins trois fois pour obtenir des triplicates biologiques. 2. Analyse des réponses transcriptionnelles β SMAD3 induites par le TGF Effectuez l’essai de journaliste transcriptionnel SMAD3/SMAD4-dependent CAGA12-luciferase. Culture et trypsinize mcf10A-Ras cellules telles que décrites dans l’étape 1. Les cellules de graines dans des plaques de 24 puits à 5×104 cellules/puits et permettent aux cellules d’adhérer pendant la nuit. Le lendemain de l’ensemencement, cotransfecter les cellules de chaque puits avec 100 ng du TGF-β/SMAD3-inducible (CAGA)12 luciferase transcriptionnelle reporter construire35 et 80 ng de l’expression β-galactosidase construire en utilisant la polyéthyllènenimine (PEI). La transfection de β-galactosidase est utilisée pour normaliser les différences dans l’efficacité de la transfection entre les différents puits. Mettre en place tous les groupes expérimentaux en triplicate. Après 24 heures d’incubation, affamer les cellules avec du glucose DMEM-haut sans sérum et, 6 heures plus tard, ajouter TGF-β (5 ng/mL) ou tampon ligand (4 mM HCl, 0,1% BSA) comme un contrôle du véhicule pour les cellules. Après encore 24 heures d’incubation, lavez les cellules deux fois avec du PBS préchauré. Ajouter 120 μL/puits 1× tampon de lyse et agiter doucement la plaque à 4 °C pendant 20 minutes. Transférer 30 μL de lysate dans chaque puits d’une microplaque blanche de 96 puits pour mesurer l’activité de la luciferase à l’aide d’un luminomètre. Transférer 50 μL de lysate dans chaque puits d’une plaque transparente de 96 puits pour mesurer β-galactosidase. Normaliser l’activité de la luciferase à l’β-galactosidase et répéter les expériences au moins trois fois pour obtenir des triplicates biologiques. Analyser l’expression des gènes cibles TGF-β à l’aide d’une réaction quantitative en chaîne en temps réel-polyméseau (qRT-PCR). Culture et trypsinize mcf10A-Ras cellules telles que décrites dans l’étape 1. Les cellules de graines dans des plaques de 6 puits à 5×105 cellules/puits et permettent aux cellules d’adhérer pendant la nuit. Traiter les cellules avec TGF-β (5 ng/mL) ou tampon ligand (4 mM HCl, 0,1% BSA) pendant 6 heures, puis laver les cellules deux fois avec 1 mL de PBS. Isoler l’ARN total à l’aide d’une trousse d’isolation arn. Déterminez la concentration d’ARN à l’aide d’un NanoDrop et effectuez la synthèse de l’ADN avec 1 μg d’ARN à l’aide d’un premier kit de synthèse de l’ADND. Utiliser un système de détection PCR en temps réel pour effectuer quantitative en temps réel-PCR (qRT-PCR) avec dix fois dilué cDNA dans un mélange de réaction de 10 μL qui comprend des amorces humaines spécifiques avant et inverse pour GAPDH (pour la normalisation), SERPINE1 (codage de la protéine PAI-1, un gène cible TGF-β/SMAD), SMAD7 (gène cible TGF-β/SMAD) et qPCR Master Mix. Mettre en place tous les groupes expérimentaux en triplicate.REMARQUE : Les séquences d’amorce utilisées pour détecter les gènes humains cibles dans qRT-PCR sont répertoriées dans le tableau 1. Utilisez les conditions de réaction qPCR suivantes : initialisation, 95 °C pendant 3 minutes; dénaturation, 95 °C pendant 10 secondes; annealing, 60 °C pendant 30 secondes; et extension, 80 °C pendant 10 secondes; la dénaturation, l’annealage et l’extension sont répétés 40 fois. Répétez les expériences au moins trois fois pour obtenir des triplicates biologiques. 3. Analyse de l’EMT β induit par le TGF Analyser l’expression des marqueurs EMT au niveau des protéines à l’aide de ballonnements occidentaux.REMARQUE : L’analyse de l’EMT induite par β TGF est montrée utilisant des cellules épithéliales de souris NMuMGcomme exemple 36,37. Cellules NMuMG de culture à 37 °C dans le milieu de glucose DMEM-haut complété avec le sérum bovin foetal de 10% et 1:100 Pen-Strep. Utilisez les méthodes décrites à l’étape 1 pour l’isolement et la détection des protéines.REMARQUE : Les anticorps suivants sont utilisés dans cette expérience : E-cadhérine, 1:1000; N-cadherin, 1:1000; Escargot, 1/1000; Limace, 1/1000; Tubulin, 1/1000 (Figure 3). Analyser l’expression des marqueurs EMT au niveau de l’ARNm à l’aide d’un PCR en temps réel quantitatif tel que décrit dans l’étape 2.2.REMARQUE : Toutes les amorces de souris utilisées pour qRT-PCR, y compris le CDH1 (codage de la protéine E-cadhérine), SNAILet ZEB2 (figure 3) sont énumérées dans le tableau 1. Analyser le processus d’EMT à l’aide d’immunofluorescence indirecte et de coloration directe par fluorescence. Coloration indirecte d’immunofluorescence de l’E-cadhérine Placer les couvertures stériles en verre carré de 18 mm dans des plaques de 6 puits (un coverslip par puits). Graine 1×105 cellules NMuMG avec 2 mL de DMEM complet par plaque de 6 puits et permettre aux cellules d’adhérer pendant la nuit. Déplacez doucement les coverslips avec des cellules adhérentes à une nouvelle plaque de 6 puits et ajoutez 2 mL de milieu de culture aux puits. Traiter les cellules avec TGF-β (5 ng/mL) ou tampon ligand (4 mM HCl, 0,1% BSA) pendant 2 jours. Retirer le milieu de culture et laver délicatement les cellules deux fois avec 1 mL de PBS préchauré. Fixez les cellules en ajoutant 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % et en couveant pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez doucement les cellules deux fois avec 1 mL de PBS. Perméabiliser les cellules fixes avec 0,1% Triton X-100 pendant 10 minutes à température ambiante et laver les cellules deux fois avec PBS. Bloquer les cellules avec 5% de BSA dans PBS pendant 1 heure à température ambiante et laver les cellules deux fois avec PBS. Ajouter l’anticorps primaire contre l’E-cadhérine (dilué 1:1000 en PBS) au sommet de chaque coverslip et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Retirer l’anticorps primaire et laver le coverslip avec PBS trois fois. Ajouter l’anticorps secondaire Alexa Fluor 555 (dilué 1:500 en PBS) au sommet de chaque coverslip et incuber pendant 1 heure à température ambiante tout en couvrant de papier d’aluminium pour se protéger de la lumière. Retirer l’anticorps secondaire et laver le coverslip avec PBS trois fois. Montez le coverslip (cellules orientées vers le bas) sur des glissières en verre à l’aide d’un support de montage avec 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) et rangez les glissières montées dans une boîte à 4 °C, à l’abri de la lumière. Observez la coloration par microscopie confoccale SP8. Coloration directe de fluorescence de filamentous (F)-actin. Préparer les échantillons suivant les étapes 3.3.1.1. à 3,3,1,9. Tacher les cellules en ajoutant Alexa Fluor 488 Phalloidin (1:1000) pendant 1 heure à température ambiante dans l’obscurité pour visualiser l’actine filamenteuse (F-actine). Laver les cellules trois fois avec PBS. Montez le coverslip sur des toboggans en verre à l’aide d’un support de montage avec DAPI et prenez des images avec la microscopie confoccale SP8.

Representative Results

Analyse de la signalisation TGF-βL’étape clé de la signalisation TGF-β est la phosphorylation des deux résidus de sérine terminale les plus carboxy dans le motif SSXS (Figure 2) par TβRI kinase38,39. Pour étudier les réponses de signalisation β TGF-β, nous avons exécuté le ballonnement occidental du SMAD2 phosphorylated. Dans les cellules mcf10A-Ras du sein humain prémalignant, la phosphorylation de SMAD2 a augmenté de manière significative en réponse à la stimulation de TGF-β pendant 1 heure, alors que l’expression du SMAD2/3 total n’a pas été affectée par le traitement de TGF-β (figure 4A). En utilisant l’analyse de journaliste transcriptionnelle CAGA-luc induite par TGF-β,4, nous avons constaté que TGF-β induit de façon marquée le journaliste luciferase dans la lignée des cellules MCF10A-Ras par rapport aux cellules non traitées (figure 4B). En outre, nous avons observé que les cibles de gène transcriptionnel direct bien caractérisées de TGF-β y compris SMAD7 et SERPINE1 (codant la protéine PAI-1), ont été fortement exprimées dans les cellules MCF10A-Ras traitées par TGF-β (figure 4C). Analyse de l’EMT β induite par le TGFNous avons évalué l’EMT induite par le TGF-β avec diverses méthodes, telles que des changements morphologiques, l’expression des marqueurs d’EMT aux niveaux d’ARNm et de protéine et la coloration d’immunofluorescence des marqueurs d’EMT36. Les cellules épithéliales de NMuMG traitées avec TGF-β pendant 1 et 2 jours ont changé d’une morphologie épithéliale classique à une morphologie mésenchymale spindle-formée, comme montré par microscopie de contraste de phase (figure 5A). Conformément aux changements morphologiques, nous avons observé que le traitement par TGF-β a entraîné une augmentation de l’expression protéique des marqueurs mésenchymaux, y compris la N-cadhérine, l’escargot et lalimace 37 (figure 5B). En revanche, e-cadhérine, un marqueur épithélial, a été downregulated dans les cellules de NMuMG après 2 jours de traitement de TGF-β (figure 5B). En outre, nous avons effectué la réaction en chaîne quantitative en temps réel-polymésase (qRT-PCR) pour étudier l’expression de gène des marqueurs d’EMT. Le CDH1 (codant pour la protéine E-cadhérine) a été considérablement diminué, tandis que les marqueurs mésenchymaux tels que l’escargot et le doigt de zinc E-box-binding homeobox 2 (ZEB2) ont été nettement augmentés après la stimulation de TGF-β dans les cellules de NMuMG comparées aux cellules non traitées ( figure5C). L’EMT β-induite par TGF dans les cellules de NMuMG a été encore confirmée par la coloration d’immunofluorescence d’E-cadherin. Lors de la stimulation du TGF-β pendant 2 jours, les cellules NMuMG ont exprimé moins d’E-cadhérine que les cellules du groupe témoin non induit, tel qu’analysé par microscopie confocale(figure 5D). En outre, les cellules NMuMG en présence de TGF-β formé plus de fibres de stress actine, comme le montre la microscopie confocales (Figure 5E). SB431542 et GW788388 inhibent la signalisation TGF-β et l’EMT induit par β TGFSB431542 est un inhibiteur compétitif de l’ATP du domaine kinase de TβRI, également appelé kinase activin receptor-like 5 (ALK5), tandis que GW788388 inhibe l’activité de kinase TβRI et TβRII. Les deux inhibiteurs peuvent inhiber le récepteur β TGF-βsignalant 40. Ainsi, nous avons traité les cellules NMuMG avec différentes concentrations de GW788388 en présence de TGF-β pendant 1 heure. Comme prévu, GW788388 inhibait la phosphorylation SMAD2 induite par le TGF-β d’une manière dépendante de la dose (figure 6A). De plus, la phosphorylation à β tégéré par TGF de SMAD2 a été bloquée par le traitement SB431542 (figure 6A). Phosphorylated SMAD2/3 forme un complexe hétéromérique avec SMAD4 et se translocalise dans le noyau pour moduler la transcription des gènes cibles. Par conséquent, nous avons étudié la translocation de SMAD2/3 dans les cellules de NMuMG par coloration d’immunofluorescence de SMAD2/3. Les données ont démontré que SB431542 et GW788388 ont inhibé de façon significative la translocation nucléaire induite par le TGF-β et l’accumulation de SMAD2/3 dans les cellules NMuMG (figure 6B). En outre, les effets inhibiteurs de SB431542 et GW788388 ont également été observés dans les niveaux d’expression de l’ARNm d’importants gènes cibles TGF-β impliqués dans l’EMT, y compris PAI-1, SNAIL, E-cadherin et Fibronectin (Figure 6C). Ces données suggèrent que SB431542 et GW788388 ont bloqué la signalisation TGF-β et l’EMT induit par β TGF. Analyse de la transdifferentiation des cellules cancéreuses mésenchymales du sein en adipocytesL’EMT joue un rôle vital dans l’amélioration de la plasticité cellulaire dans les cancers et entraîne le développement d’une résistance thérapeutique. La plasticité des cellules cancéreuses peut être directement ciblée et inhibée par une approche de trans-différenciation, telle que l’adipogenèseforcée 30. Nous avons employé les cellules de cancer du sein murine de Py2T, qui ont été dérivées de la glande mammaire d’une souris mammary tumeur virus-polyoma moyenne tumeur-antigène (MMTV-PyMT) souris transgénique, comme modèle cellulaire de plasticité induite par EMT cellule cancéreuse. Basé sur un protocole établi41, nous avons traité les cellules cancéreuses du sein py2T murine dérivées de l’EMT avec le médicament antidiabétique rosiglitazone pendant 10 jours pour induire l’adipogenèse. L’adipogenèse a été évaluée en visualisant des gouttelettes de lipide utilisant la coloration rouge d’O d’huile. Les cellules adipeuses ont été facilement détectées dans les cellules cancéreuses du sein py2T murine traitées par rosiglitazone (figure 7), qui ont démontré que le traitement par rosiglitazone seul est suffisant pour favoriser la transdifferentiation des cellules cancéreuses du sein dérivées de l’EMT en adipocytes. Figure 1 : Signalisation TGF-β/SMAD. La signalisation TGF-β s’initie à la liaison du TGF-β au récepteur de type II TGF-β (TβRII), une kinase constitutivement active, qui phosphorylate le récepteur TGF-β de type I (TβRI). Puis, activé TβRI kinase phosphorylates SMAD2/3. Un peptide contenant le motif SSXS de SMAD2 avec deux résidus de sérine phosphorylatée terminale carboxy a été utilisé pour obtenir l’antisera polyclonal reconnaissant le phosphore-SMAD2 (p-SMAD2). Par conséquent, l’analyse de l’expression p-SMAD2 par ballonnement occidental peut être utilisée pour déterminer l’activation de la voie de signalisation TGF-β’Œil. Phosphorylated SMAD2/3 peut former des complexes hétéromériques avec SMAD4, qui se translocaliser ensuite dans le noyau pour moduler les réponses transcriptionnelles. L’analyse du journaliste CAGA12-luciferase et le PCR quantitatif en temps réel (qRT-PCR) pour l’expression de l’ARNm des gènes cibles TGF-β tels que SMAD7 et SERPINE1 (codant pour la protéine PAI-1) peuvent être utilisés pour analyser les réponses transcriptionnelles dépendantes du TGF-β induites par le SMAD3. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2 : Structure schématique des R-SMAD (SMAD2 et SMAD3). Les domaines MH1 (bleu) et MH2 (jaune) sont conservés parmi les R-SMAD, mais la région linker (gris) n’est pas conservée. Le domaine MH1 de SMAD3 abrite un motif liant l’ADN, tandis que SMAD2 ne peut pas lier directement l’ADN, en raison d’une insertion (exon 3) dans son domaine MH1. Le domaine MH2 médie l’oligomérisation SMAD, l’interaction avec les récepteurs TGF-β, et la liaison protéique et est impliqué dans la régulation transcriptionnelle. SMAD2 et SMAD3 peuvent être activés par la phosphorylation du motif SSXS (en rouge) dans leur termini C. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : TGF-β induite par le TGF. Pendant la transition épithéliale-mésenchymale (EMT) induite par TGF-β), les cellules subissent la perte des caractéristiques épithéliales et d’acquisition des caractéristiques mésenchymales avec la motilité cellulaire accrue et la capacité d’invasion. L’induction de l’EMT conduit à l’expression de marqueurs mésenchymaux tels que N-cadherin, Zeb2 et Snail1/2, ainsi qu’à la downregulation des marqueurs épithéliales, y compris e-cadhérine, β-caténine et claudin-1. La perte ou le gain accumulé de caractéristiques épithéliales/mésenchymales (E/M) fait entrer une cellule dans les états intermédiaires d’une manière réversible. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4 : Réactions de signalisation β TGF-β dans les cellules MCF10A-Ras. (A) Les cellules MCF10A-Ras ont été traitées avec ou sans TGF-β (2,5 ng/mL) pendant 1 heure, et les lysates cellulaires ont été immunoblotted pour SMAD2 phosphorylated (p-SMAD2), SMAD2/3 total et GAPDH (comme contrôle de chargement). Le marqueur de taille est affiché sur la droite. Con: Groupe témoin sans traitement β TGF. (B) Analyse de l’activité TGF-β (5 ng/mL) à l’aide du journaliste transcriptionnel CAGA12-luciferase (LUC) dépendant du SMAD3-SMAD4 dans les cellules MCF10A-Ras. Les valeurs sont normalisées pour β-galactosidase (βGal). Les données sont exprimées comme la ± s.d, n = 3. Test t de l’étudiant, ***P ≤ 0,001 (C) analyse qRT-PCR des gènes cibles TGF-β SMAD7 et SERPINE1 (codage de la protéine PAI-1) dans les cellules MCF10A-Ras traitées avec TGF-β (2,5 ng/mL) pendant 6 heures. Gapdh a été utilisé comme un contrôle interne. Les données sont exprimées comme la ± s.d, n = 3. Student’s t test, ***P ≤ 0.001. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 5 : TGF-β induite par le TGF dans les cellules NMuMG. (A) Morphologie des cellules NMuMG traitées avec TGF-β (2,5 ng/mL) pendant 1 ou 2 jours. En présence de TGF-β, les cellules de NMuMG se sont transdifférenciées en phénotype mésenchymal. Barre d’échelle = 150 μm (B) Les cellules NMuMG ont été traitées avec ou sans TGF-β (5 ng/mL) pendant 2 jours, et les marqueurs EMT ont été analysés par ballonnement occidental. Le marqueur de taille est indiqué sur la droite. Con: Groupe témoin sans traitement β TGF. (C) Analyse de l’expression génétique des marqueurs EMT (CDH1 (codage de la protéine E-cadhérine), ESCARGOT et ZEB2) dans les cellules NMuMG traitées pendant 2 jours avec TGF-β (5 ng/mL). Gapdh a été utilisé comme un contrôle interne. Les résultats sont exprimés comme la moyenne ± s.d., n = 3. T-test de l’étudiant, *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01, ***P ≤ 0,001. (D) Les cellules NMuMG ont été tachées par immunofluorescence pour détecter l’expression du marqueur épithélial E-cadhérine (rouge) après traitement TGF-β (2,5 ng/mL) pendant 2 jours. Les noyaux ont été contre-tachés avec DAPI (bleu). Des images ont été capturées avec la microscopie confoccale. Barre d’échelle = 50 μm (E) Les cellules NMuMG ont été tachées de fluorescéine-phalloidine (verte) pour visualiser la F-actine. Les noyaux ont été contre-tachés avec DAPI (bleu). Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 6 : L’EMT induit par le TGF-βsignaling et le TGF-β ont été inhibés par SB431542 et GW7883888. (A) Les cellules NMuMG ont été traitées avec 10 μM de SB431542 (SB) ou les concentrations indiquées de GW788388 (GW) en présence ou en absence de TGF-β (5 ng/mL) pendant 1 heure. Les lysates cellulaires ont été immunoblotted pour p-SMAD2, SMAD2/3 et GAPDH. (B) Les cellules NMuMG ont été traitées avec 5 μM de SB431542 (SB) ou 10 μM de GW788388 (GW) en présence ou en absence de 5 ng/mL de TGF-β pendant 1 heure et tachées par immunofluorescence pour détecter la translocation nucléaire de SMAD2/3 (vert). Des images ont été capturées avec la microscopie confoccale. (C) L’expression des gènes cibles TGF-β, y compris pai-1 et les gènes codant marqueurs EMT, y compris SNAIL, E-Cadherin et Fibronectin, ont été analysés par réaction en chaîne de polymése de transcriptase inverse (RT-PCR) dans les cellules NMuMG après le traitement SB ou GW et la stimulation TGF-β pendant 48 heures. GAPDH a servi de contrôle de chargement. Le contrôle désigne les cellules non traitées. Ce chiffre a été modifié de Petersen M. et coll. 34 avec la permission de l’éditeur. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 7 : Les cellules cancéreuses du sein py2T murine dérivées de l’EMT peuvent être amenées à se différencier en adipocytes. Les cellules cancéreuses du sein de murine de Py2T ont été stimulées avec 2 ng/mL TGF-β pendant 20 jours pour induire l’EMT complet. Ensuite, les cellules ont été traitées soit avec DMSO comme un contrôle du véhicule ou rosiglitazone (2 μM) pendant 10 jours pour permettre la différenciation des cellules cancéreuses mésenchymales et induire l’adipogenèse. Le médium a été changé tous les 2 jours. Après 10 jours de traitement, les cellules ont été tachées d’huile rouge O. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. espèce Nom du gène Attaquant (5′ à 3′) Revers (5′ à 3′) humain GAPDH (GAPDH) TGCACCACCAACTGCTTAGC GGCATGGACTGTGGTCATGAG SMAD7 (en) TCCCAGATGCTGTGCCTTCC GTCCGAATTGAGCTGTCCG SERPINE1 (SERPINE1) CACAAATCAGACGGCAGCACT CATCGGGCGTGGTGAACTC CATCGGGCGTGGTGAACTC CATCGGGCGTGGTGAACTC souris GAPDH (GAPDH) TGGCAAAGTGGAGATTGTTGCC AAGATGGTGATGGGCTTCCCG CDH1 (en) ACCAAAGTGACGCTGAAGTC GAGGATGTACTTGGCAATGG escargot CAGCTGGCCAGGCTCTCGGT (en) GCGAGGGCCTCCGGAGCA ZEB2 (en) TTCTGCAAGCCTCTGTAGCC TTCTGGCCCCATTGCAT Tableau 1 : Amorce utilisée pour qRT-PCR.

Discussion

La signalisation TGF-β/SMAD joue un rôle central dans la progression du cancer du sein, car elle peut favoriser l’invasivité et la métastase des cellules cancéreuses du sein en induisant l’EMT⁷. Ici, nous avons décrit un workflow logique pour étudier la signalisation TGF-β-initiée de l’activation de SMAD récepteur-induite aux réponses transcriptionnelles et biologiques SMAD-médiées. Nous avons commencé par décrire l’analyse de la phosphorylation SMAD2, nous avons continué avec les réponses transcriptionnelles dépendantes du SMAD3 induites par TGF-β et l’expression des marqueurs EMT aux niveaux de gène et de protéines pour analyser la réponse de signalisation TGF-β/SMAD, et avons finalement examiné l’EMT induit par le TGF-β. Nous avons utilisé le journaliste transcriptionnel CAGA₁₂-luciferase contenant des boîtes CAGA dérivées du promoteur PAI-1, pour surveiller l’activité de la voie de signalisation TGF-β/SMAD³⁵. Cette construction reporter nécessite SMAD3 et SMAD4 pour l’activation. Des études antérieures ont montré que l’effondrement de SMAD4 atténué TGF-β induit caga₁₂-luciferase activité³⁷. En plus de l’analyse du journaliste, la détermination de l’état de phosphorylation des SMAD endogènes, y compris SMAD2 et SMAD3, est une autre façon d’étudier la réponse de signalisation TGF-β. En effet, d’autres membres de la famille TGF-β, tels que le facteur de croissance et de différenciation (GDF)-8/myostatine et GDF-9, transduisent également des signaux via les protéines SMAD2/3 en engageant TβRI^42,43,44. En plus dujournaliste CAGA 12-luciferase, plusieurs journalistes similaires ont été utilisés pour détecter l’activation de la signalisation TGF-β. Par exemple, un journaliste transcriptionnel (SBE)₄-Lux avec des éléments de réponse dérivés du promoteur JunB peut être efficacement induit par TGF-β, activins et BMPs⁴⁵.

Le ballonnement occidental et le qPCR ont été utilisés pour analyser l’EMT induit par le TGF-β, qui sont des méthodes classiques pour étudier l’expression des marqueurs épithéliales (c.-à-d. E-cadherin) et des marqueurs mésenchymaux (c.-à-d. N-cadherin, escargot, limace et Zeb2). Nous avons également exécuté la coloration indirecte d’immunofluorescence de E-cadherin et la coloration directe de fluorescence de F-actin. Ces analyses ont également validé le phénotype mésenchymal des cellules après traitement de TGF-β. La limitation de la coloration de l’immunofluorescence est que les cellules doivent être fixées avant l’incubation avec des anticorps et l’imagerie, et il est difficile d’étudier les changements dans l’expression des marqueurs EMT dans les cellules vivantes. Récemment, la conception des lignées de cellules reporter EMT, telles que l’adénocarcinome-vimentin-DFP pulmonaire A549, a permis de surveiller la transformation des cellules épithéliales en cellules mésenchymales en temps réel par l’expression de la vimentine taguée par protéine fluorescente rouge (DP). Cette plate-forme pourrait être utilisée pour le dépistage des médicaments et le développement de nouveaux^{médicaments 46}. LifeAct colorant, un peptide de 17 acides aminés, qui peut tacher les structures F-actine dans les cellules vivantes, devient un outil précieux pour visualiser le cytosquelette d’actine en temps réel sans interférer avec les processus cellulaires⁴⁷. Dans cette étude, nous avons utilisé deux inhibiteurs de petites molécules, SB431542 et GW7883888, pour valider leur effet inhibiteur sur la signalisation TGF-β et l’EMT induit par le TGF-β. Notamment, GW788388 inhibe efficacement l’activité TβRI et TβRII, tandis que SB431542 a un effet inhibiteur sur seulement TβRI (et ALK4 et ALK7). Des études antérieures ont révélé que GW788388 est plus puissant in vivo que SB431542⁴⁰. En plus de l’inhibition de l’EMT, GW788388 a réduit l’expression des marqueurs de fibrose dans le rein, et l’administration orale de GW788388 chez les souris diabétiques a nettement diminué la glomerulopathie^25,48.

L’EMT joue un rôle essentiel dans la promotion de la plasticité des cellules cancéreuses et entraîne une résistance aux médicaments et des ^{métastases 49}. Par conséquent, le ciblage des cellules dérivées de l’EMT avec des médicaments cytotoxiques^{spécifiques 50} ou induisant la redifferentiation par la transition mésenchymal-épithéliale (MET)⁵¹ a été proposé comme approche pour surmonter la métastase de cellules cancéreuses et la résistance de thérapie. Cependant, met contribue à la prolifération des cellules cancéreuses disséminées dans les organes éloignés^52,qui pourraient être contreproductifs en utilisant le retour thérapeutique de l’EMT. Récemment, une nouvelle étude a rapporté une approche thérapeutique de transdifferentiation en ciblant directement les cellules cancéreuses du sein emt-dérivées pour la différenciation en adipocytes^30. L’étude d’Ishay-Ronen et. al.³⁰ a employé les cellules cancéreuses épithéliales de murine de Py2T qui avaient subi une transition aux cellules mésenchymales en réponse au traitement à long terme avec TGF-β. Ils ont démontré que la rosiglitazone en combinaison avec les inhibiteurs de MEK a amélioré la différenciation épithéliale et l’adipogenèse. Cependant, nous avons constaté que la rosiglitazone seule était suffisante pour induire la transdifferentiation des cellules murines mésenchymales de Py2T dans les adipocytes.

En résumé, les méthodes utilisées dans cette étude ont fourni un flux de travail logique pour étudier la signalisation TGF-β et l’EMT induit par β TGF-β. Les deux inhibiteurs, SB431542 et GW788388, peuvent bloquer les réponses induites par le TGF-β et l’EMT. En outre, nous avons également démontré rosiglitazone seul induit l’adipogenèse dans certaines cellules cancéreuses mésenchymales induites par TGF-β. Bien que nous n’avons utilisé que plusieurs lignées de cellules cancéreuses du sein pour étudier les réponses de TGF-β, les méthodes décrites ici pourraient être extrapolées à d’autres cellules (cancéreuses). Ici, nous avons utilisé diverses concentrations de TGF-β pour induire des réponses cellulaires. Dans la plupart des types de cellules, TGF-β exerce son activité biologique dans la gamme de concentration de 0,01-10 ng/mL⁵³ et induit la signalisation dans un modèle dose-réponse. Dans les cellules endothéliales primaires, y compris les cellules endothéliales aortiques bovines, le TGF-β a induit l’expression substantielle de SMAD2 phosphoré à 0,025 ng/mL, a atteint un maximum à 0,25 ng/mL, et est resté à ce niveau en réponse à des concentrations^{plus élevées 53}. Dans notre étude, nous avons utilisé une forte concentration de TGF-β (5 ng/mL) dans les cellules MCF10A-Ras pour l’essai transcriptionnel de journaliste pour obtenir des réponses fortes. La phosphorylation SMAD2 et l’expression des gènes cibles peuvent être induites par le TGF-β à faible dose; ainsi, nous avons employé 2.5 ng/mL TGF-β pour traiter des cellules. Cependant, la concentration de travail la plus appropriée dépend du type de cellule et des effets estimés. Pour déterminer la meilleure concentration de TGF-β, il est recommandé de traiter les cellules avec des doses différentes (de faibles à élevées).

Materials

Reagent
18 mm-side square glass coverslips	Menzel Gläser	631-1331
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Vector Laboratories	H-1200
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
Alexa Fluor 555 secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-21422
Anti-E-cadherin antibody	BD Biosciences	610181
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) antibody	Merck Millipore	MAB374
Anti-N-cadherin antibody	BD Biosciences	610920
Anti-Slug antibody	Cell Signaling Technology	9585
anti-SMAD2/3 antibody	Becton Dickinson	610842
Anti-Snail antibody	Cell Signaling Technology	3879
Anti-Tubulin antibody	Cell Signaling Technology	2148
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A2058
Cholera enterotoxin	Sigma-Aldrich	C8052
Clarity Western ECL Substrate	Bio-Rad	1705060
DC protein assay kit	Bio-Rad	5000111
DMEM-high glucose	Thermo Fisher Scientific	11965092
DMEM-high glucose medium	Thermo Fisher Scientific	11965092
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/F12	Thermo Fisher Scientific	11039047
epidermal growth factor (EGF)	Merck Millipore	01-107
Fetal bovine serum (FBS)	BioWest	S1860-500
GoTaq qPCR Master Mix	PROMEGA	A600X
Horse serum	Thermo Fisher Scientific	26050088
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0135
Insulin	Sigma-Aldrich	91077C
Mini Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836153001
NucleoSpin RNA II kit	BIOKE´	740955
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)	Thermo Fisher Scientific	15140148
Polyethylenimine (PEI)	Polyscience	23966
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Merck Millipore	IPVH00010
Ponceau S solution	Sigma-Aldrich	P7170
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific	K1621
Skimmed milk	Campina: Elk
Equipment
ChemiDoc Imaging System	Bio-Rad	17001402
CFX Connect Detection System	Bio-Rad	1855201
Luminometer	Perkin Elmer	2030-0050
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermo Fisher Scientific	ND-2000