माउस कोक्लीआ में स्ट्रियल रक्त प्रवाह का मापन एक ओपन वेसल-विंडो और इंट्रावाइटल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना
Summary
फ्लोरोसेंट ट्रेसर का उपयोग करके एक खुली पोत-खिड़की दृष्टिकोण कोक्लियर रक्त प्रवाह (सीओबीएफ) माप के लिए पर्याप्त संकल्प प्रदान करता है। विधि सामान्य और रोग स्थितियों के तहत माउस में सीओबीएफ में संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तनों के अध्ययन की सुविधा प्रदान करती है।
Abstract
ध्वनि का पारगमन चयापचय की मांग है, और पार्श्व दीवार में माइक्रोवास्कुलचर का सामान्य कार्य एंडोकोक्लियर क्षमता, आयन परिवहन और द्रव संतुलन बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। श्रवण विकारों के विभिन्न रूपों में कोक्लीआ में असामान्य माइक्रोसर्कुलेशन शामिल होने की सूचना है। कॉक्लियर रक्त प्रवाह (सीओबीएफ) विकृति सुनवाई समारोह को कैसे प्रभावित करती है, इसकी जांच व्यवहार्य पूछताछ विधियों की कमी और आंतरिक कान तक पहुंचने में कठिनाई के कारण चुनौतीपूर्ण है। पार्श्व कॉक्लियर दीवार में एक खुली पोत-खिड़की, प्रतिदीप्ति इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त, विवो में सीओबीएफ परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए उपयोग की गई है, लेकिन ज्यादातर गिनी पिग में और हाल ही में माउस में। यह पेपर और संबंधित वीडियो माउस कोक्लीआ में रक्त प्रवाह की कल्पना करने के लिए खुले पोत-खिड़की विधि का वर्णन करते हैं। विवरण में 1) चूहों से फ्लोरोसेंट-लेबल रक्त कोशिका निलंबन की तैयारी शामिल है; 2) एक संवेदनाहारी माउस में इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी के लिए एक खुली पोत-खिड़की का निर्माण, और 3) इमेजिंग की ऑफ़लाइन रिकॉर्डिंग का उपयोग करके रक्त प्रवाह वेग और मात्रा का माप। विधि को वीडियो प्रारूप में प्रस्तुत किया जाता है ताकि यह दिखाया जा सके कि सामान्य और रोग स्थितियों के तहत कॉक्लियर माइक्रोसर्कुलेशन में संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तनों की जांच करने के लिए माउस में खुली खिड़की दृष्टिकोण का उपयोग कैसे किया जाए।
Introduction
पार्श्व कोक्लियर दीवार में माइक्रोसर्कुलेशन का सामान्य कार्य (सर्पिल स्नायुबंधन और स्ट्रिया संवहनी में अधिकांश केशिकाओं को शामिल करना) श्रवण समारोह1 को बनाए रखने के लिए गंभीर रूप से महत्वपूर्ण है। असामान्य सीओबीएफ शोर-प्रेरित सुनवाई हानि, कान हाइड्रोप्स और प्रेस्बिक्यूसिस 2,3,4,5,6,7,8,9 सहित कई आंतरिक कान विकारों के पैथोफिजियोलॉजी में फंसा हुआ है। इंट्रावाइटल सीओबीएफ का विज़ुअलाइज़ेशन श्रवण समारोह और कॉक्लियर संवहनी विकृति विज्ञान के बीच संबंधों की बेहतर समझ को सक्षम करेगा।
यद्यपि लौकिक हड्डी के भीतर कोक्लीआ की जटिलता और स्थान सीओबीएफ के प्रत्यक्ष दृश्य और माप को रोकता है, लेजर-डॉपलर फ्लोमेट्री (एलडीएफ) 10,11,12, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) 13, प्रतिदीप्ति इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी (एफआईवीएम) 14, प्रतिदीप्ति माइक्रोएंडोस्कोपी (एफएमई) सहित सीओबीएफ के मूल्यांकन के लिए विभिन्न तरीकों को विकसित किया गया है। , और रक्तप्रवाह में लेबल मार्करों और रेडियोधर्मी रूप से टैग किए गए माइक्रोस्फीयर के इंजेक्शन के आधार पर दृष्टिकोण (ऑप्टिकल माइक्रोएंजियोग्राफी, ओएमएजी) 17,18,19,20। हालांकि, इनमें से किसी भी विधि ने एफआईवीएम के अपवाद के साथ विवो में सीओबीएफ में परिवर्तनों की पूर्ण वास्तविक समय ट्रैकिंग को सक्षम नहीं किया है। एफआईवीएम, पार्श्व कॉक्लियर दीवार में एक पोत-खिड़की के साथ संयोजन में, एक दृष्टिकोण है जिसका उपयोग विभिन्न प्रयोगशालाओं14,21,22 द्वारा विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत गिनी पिग में किया गया है और मान्य किया गया है।
फ्लोरोसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) -डेक्सट्रान का उपयोग करके माउस में कॉक्लियर माइक्रोसर्कुलेशन में संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक एफआईवीएम विधि सफलतापूर्वक स्थापित की गई थी- एक विपरीत माध्यम और एक प्रतिदीप्ति डाई-या तो डीआईओ (3, 3′-डायोक्टाडेसिलोक्साकार्बोसायनिन परक्लोरेट, हरा) या दिल (1,1-डायोक्टाडेसिल -3,3,3,3)- वर्तमान अध्ययन में, इस पद्धति के प्रोटोकॉल को सामान्य और रोग स्थितियों (जैसे शोर जोखिम के बाद) के तहत माउस में सीओबीएफ में इमेजिंग और परिवर्तनों की मात्रा निर्धारित करने के लिए वर्णित किया गया है। यह तकनीक शोधकर्ता को स्ट्रिया संवहनी में श्रवण शिथिलता और विकृति विज्ञान से संबंधित सीओबीएफ के अंतर्निहित तंत्र की जांच करने के लिए आवश्यक उपकरण देती है, खासकर जब आसानी से उपलब्ध ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के साथ संयोजन के रूप में लागू किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पेपर दर्शाता है कि माउस मॉडल की कॉक्लियर पार्श्व दीवार (और स्ट्रिया संवहनी में) में केशिकाओं को एफआईवीएम प्रणाली के तहत एक खुले पोत-खिड़की की तैयारी में फ्लोरोफोर लेबलिंग के साथ कैसे देखा जा सकता है?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह शोध एनआईएच / एनआईडीसीडी आर 21 डीसी 016157 (एक्स.शी), एनआईएच / एनआईडीसीडी आर 01 डीसी 015781 (एक्स.शी), एनआईएच / एनआईडीसीडी आर 01-डीसी 010844 (एक्स.शी), और ओरेगन हेल्थ एंड साइंस यूनिवर्सिटी (ओएचएसयू) (एक्स.शि) से मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन द्वारा समर्थित था।
Materials
| 0.9% Sodium Chloride | Hospira | NDC 0409-1966-02 | 0.6 mL (for 1 mL) |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | 20 µM |
| 3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorateDio (3,3′-Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | D4292 | 20 µM |
| CODA Monitor system | Kent scientific | CODA Monitor, for monitoring blood pressure and heartbeat | |
| Coverslip | Fisher Scientific | 12-542A | |
| DC Temperature Controller | FHC | 40-90-8D | |
| Fiji/ImageJ | NIH | Measurement of vessel diameter | |
| FITC-dextran (2000 kDa) | Sigma Aldrich | FD2000s | 40 mg/mL |
| Heparin Sodium Injection, USP MDV | Mylan | NDC 67457-374-12 | 5000 USP units/mL |
| Katathesia (100 mg/mL) | Henry Schein | NDC 11695-0702-1 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Microscope Objective | Mitutoyo | 378-823-5 | Model: M Plan Apo NIR 10x |
| ORCA-ER Camera | Hamamatsu | Model: C4742-80-12AG | |
| PBS | Gibco | 2085387 | |
| Xyzaine (100 mg/ml, 5x diluted for use ) | Lloyd | LPFL04821 | 0.2 mL (for 1 mL) |
| Zoom Stereo Microscope | Olympus | Model: SZ61, fluorescent microscope |
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