Вскрытие и живая визуализация поздней эмбриональной гонады дрозофилы
Summary
Здесь мы предоставляем протокол вскрытия, необходимый для живого изображения поздней эмбриональной мужской гонады дрозофилы . Этот протокол позволит наблюдать динамические клеточные процессы в нормальных условиях или после трансгенных или фармакологических манипуляций.
Abstract
Мужская эмбриональная гонада Drosophila melanogaster является выгодной моделью для изучения различных аспектов биологии развития, включая, но не ограничиваясь, развитием половых клеток, биологией пиРНК и формированием ниш. Здесь мы представляем технику препарирования для живого изображения гонады ex vivo в период, когда живая визуализация in vivo крайне неэффективна. В этом протоколе описывается, как перенести эмбрионы в тарелку для визуализации, выбрать соответствующие мужские эмбрионы и рассечь гонаду от окружающих тканей, сохраняя при этом ее структурную целостность. После вскрытия гонады могут быть изображены с помощью конфокального микроскопа для визуализации динамических клеточных процессов. Процедура вскрытия требует точного времени и ловкости, но мы даем представление о том, как предотвратить распространенные ошибки и как преодолеть эти проблемы. Насколько нам известно, это первый протокол рассечения для эмбриональной гонады Drosophila , и он позволит получать живую визуализацию в течение недоступного периода времени. Этот метод может быть объединен с фармакологическими или специфическими трансгенными манипуляциями клеточного типа для изучения любых динамических процессов, происходящих внутри или между клетками в их естественной гонадной среде.
Introduction
Яичко Drosophila melanogaster послужило парадигмой для нашего понимания многих динамических клеточных процессов. Исследования этой модели пролили свет на регуляцию деления стволовых клеток 1,2,3, развитие половых клеток 4,5, биологию пиРНК 6,7,8 и сигнальные события нишевых стволовых клеток 9,10,11,12,13. Эта модель выгодна, потому что она генетически поддаетсялечению 14,15 и является одной из немногих, где мы можем воспроизвести стволовые клетки в их естественной среде 3,16,17,18. Тем не менее, живая визуализация этой модели была ограничена взрослой тканью и ранними эмбриональными стадиями, оставляя пробел в наших знаниях о динамике гонад у позднего эмбриона, точной стадии, когда ниша впервые формируется и начинает функционировать.
Эмбриональная гонада поздней стадии представляет собой сферу, состоящую из соматических нишевых клеток в передней части и половых клеток, энцистированных соматическими гонадными клетками в более задних областях19. Этот орган может быть изображен живым in vivo вплоть до ранней эмбриональной стадии 17 17,20,21. Дальнейшая визуализация предотвращается из-за инициирования крупномасштабных мышечных сокращений. Эти сокращения настолько серьезны, что выталкивают гонаду из кадра изображения, и такое движение не может быть исправлено с помощью программного обеспечения для визуализации. Наша лаборатория заинтересована в раскрытии механизмов формирования ниши, которое происходит в этот неуловимый период для живой визуализации. Поэтому мы создали подход ex vivo к живому изображению гонады, начиная с эмбриональной стадии 16, облегчая изучение динамики клеток в этот критический период развития гонад. Предыдущая работа нашей лаборатории показывает, что эта визуализация ex vivo точно повторяет развитие in vivo gonad 17. Эта методика является первой и единственной в своем роде для эмбриональной гонады дрозофилы.
Здесь мы представляем протокол рассечения, необходимый для визуализации гонады ex vivo в режиме реального времени на поздних эмбриональных стадиях. Этот протокол может сочетаться с фармакологическим лечением или трансгенными манипуляциями с конкретными клеточными линиями в пределах гонады. Используя эту технику, мы успешно изобразили этапы формирования ниши стволовых клеток17. Таким образом, этот подход к визуализации играет важную роль в области биологии стволовых клеток, поскольку он позволит визуализировать начальные стадии формирования ниши в режиме реального времени в естественной среде15,17. Хотя этот метод полезен для области биологии стволовых клеток, он дополнительно применим для визуализации любых динамических процессов, происходящих в гонаде в течение этой временной точки развития, включая клеточные перестройки22, клеточную адгезию 2,12,23 и миграцию клеток23. Таким образом, этот протокол рассечения улучшит наше понимание многих фундаментальных клеточных биологических процессов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Во время гонадогенеза эмбриональная гонада, и особенно ниша стволовых клеток в мужской гонаде15, претерпевает быстрые морфологические изменения. Механизмы развития, лежащие в основе этих динамических изменений, лучше всего понимаются с помощью методов визуализации в реал…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Линдси В. Плассаерта и Джастина Суя за их существенный вклад в раннюю разработку этого протокола. Авторы благодарны сообществу мух за их щедрость с реагентами, и особенно Рут Леманн и Бенджамин Лин за их дар nos5′-Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3′ line до его публикации. В этом исследовании использовались запасы, полученные из Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537). Эта работа была поддержана NIH RO1 GM060804, R33AG04791503 и R35GM136270 (S.D), а также учебными грантами T32GM007229 (B.W.) и F32GM125123 (L.A.).
Materials
| Alfa Aesar Tungsten wire | Fisher Scientific | AA10408G6 | 0.25mm (0.01 in.) dia., 99.95% (metals basis) |
| D. melanogaster: His2Av::mRFP1 | Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) | FBtp0056035 | Schuh, Lehner, & Heidmann, Current Biology, 2007 |
| D. melanogaster: nos-lifeact::tdtomato | Gift from Ruth Lehmann Lab | Lin, Luo, & Lehmann, Nature Communications, 2020: nos5'- Lifeact-tdtomato p2a tdkatushka2 Caax nos3' | |
| D. melanogaster: P-Dsix4-eGFP::Moesin | FBtp0083398 | Sano et al., PLoS One, 2012 | |
| Diamond-tipped knife | |||
| Double-sided tape | Scotch | 665 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 10082 | |
| Imaging dish | MatTek | P35GC-1.5-14-C | |
| Imaging software | Molecular Devices | MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software v7.8.4.0 | |
| Insulin, bovine | Sigma | l0516 | Store aliquots at 4 °C |
| Needle holder | Fisher Scientific | 08-955 | |
| Nytex basket | |||
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Ringer's solution | 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 130 mM NaCl, 5mM KCl, 36 mM Sucrose, 5mM Hepe’s Buffer; adjusted with NaOH until pH of 7.3 is achieved | ||
| Schneider's Insect Media | GIBCO | 21720-024 |
Riferimenti
- Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome. Science. 301, 1547-1550 (2003).
- Inaba, M., Yuan, H., Salzmann, V., Fuller, M. T., Yamashita, Y. M. E-Cadherin is required for centrosome and spindle orientation in Drosophila male germline stem cells. PLoS One. 5, 1-7 (2010).
- Lenhart, K. F., DiNardo, S. Somatic cell encystment promotes abscission in germline stem cells following a regulated block in cytokinesis. Developmental Cell. 34, 192-205 (2015).
- Hardy, R. W., Tokuyasu, K. T., Lindsley, D. L., Garavito, M. The Germinal Proliferation Center in the Testis of Drosophila melanogaster. Journal of Ultrastructure Research. 69, 180-190 (1979).
- Fuller, M. T., Bate, M., Arias, A. M. Spermatogenesis. The Development of Drosophila Melanogaster. , 71-147 (1993).
- Lin, H., Spradling, A. C. A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary. Development. 124, 2463-2476 (1997).
- Emilie, Q., Amit, A., Kai, T. The piRNA pathway is developmentally regulated during spermatogenesis in Drosophila. RNA. 22, 1044-1054 (2016).
- Marie, P. P., Ronsseray, S., Boivin, A. From embryo to adult: PiRNA-mediated silencing throughout germline development in Drosophila. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7, 505-516 (2017).
- Michel, M., Raabe, I., Kupinski, A. P., Pérez-Palencia, R., Bökel, C. Local BMP receptor activation at adherens junctions in the Drosophila germline stem cell niche. Nature Communications. 2, (2011).
- Inaba, M., Buszczak, M., Yamashita, Y. M. Nanotubes mediate niche-stem-cell signalling in the Drosophila testis. Nature. 523, 329-332 (2015).
- Leatherman, J. L., Dinardo, S. Zfh-1 controls somatic stem cell self-renewal in the Drosophila testis and nonautonomously influences germline stem cell self-renewal. Cell Stem Cell. 3, 44-54 (2008).
- Leatherman, J. L., DiNardo, S. Germline self-renewal requires cyst stem cells, while stat regulates niche adhesion in Drosophila testes. Nature Cell Biology. 12, (2010).
- Tulina, N., Matunis, E. Control of stem cell self-renewal in Drosophila Spermatogenesis by JAK-STAT signaling. Science. 294, 2546-2549 (2001).
- Gonczy, P., Viswanathan, S., Dinardo, S. Probing spermatogenesis in Drosophila with P-element enhancer detectors. Development. 114, 89-98 (1992).
- Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Biologia dello sviluppo. 294, 92-103 (2006).
- Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in drosophila testis. Current Protocols in Stem Cell Biology. 0331, 1-9 (2009).
- Anllo, L., Plasschaert, L. W., Sui, J., DiNardo, S. Live imaging reveals hub cell assembly and compaction dynamics during morphogenesis of the Drosophila testis niche. Biologia dello sviluppo. 446, 102-118 (2019).
- Rebecca Sheng, X., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
- Aboim, A. N. Developpement embryonnaire et post-embryonnaire des gonades normales et agametiques de Drosophila melanogaster. Revue Suisse De Zoologie. 52, 53 (1945).
- Sano, H., et al. The Drosophila actin regulator ENABLED regulates cell shape and orientation during gonad morphogenesis. PLoS One. 7, (2012).
- Clark, I. B. N., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration. BMC Devlopmental Biology. 7, 1-9 (2007).
- Sheng, X. R., Brawley, C. M., Matunis, E. L. Dedifferentiating spermatogonia outcompete somatic stem cells for niche occupancy in the Drosophila testis. Cell Stem Cell. 5, 191-203 (2009).
- Tanentzapf, G., Devenport, D., Godt, D., Brown, N. H. Europe PMC Funders Group integrin-dependent anchoring of a stem cell niche. Nature Cell Biology. 9, 1413-1418 (2007).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically a motorized molluscicide dispenser. Bulletin of the World Health Organization. , 105-106 (1960).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- JoVE. Embryo and Larva Harvesting and Preparation. JoVE Science Education Database. , (2020).
- Cold Spring Harbor Protocols. Ringer’s solution for Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. , (2011).
- Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into Centromeres during Early Embryonic Anaphase. Current Biology. 17, 237-243 (2007).
- Lin, B., Luo, J., Lehmann, R. Collectively stabilizing and orienting posterior migratory forces disperses cell clusters in vivo. Nature Communications. 11, 1-16 (2020).
- Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
- Gabay, L., Lowell, S., Rubin, L. L., Anderson, D. J. Deregulation of dorsoventral patterning by FGF confers trilineage differentiation capacity on CNS stem cells in vitro. Neuron. 40, 485-499 (2003).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
