Pupal en volwassen injecties voor RNAi en CRISPR Gen editing in Nasonia vitripennis
Summary
Hier beschrijven we methoden voor efficiënte pop- en volwassen injecties in Nasonia vitripennis als toegankelijke alternatieven voor embryomicro-injectie, waardoor functionele analyse van genen van belang mogelijk is met behulp van RNA-silencing via RNA-interferentie (RNAi) of gen knock-out via CRISPR / Cas9 genoombewerking.
Abstract
De juweelwesp, Nasonia vitripennis, is een efficiënt modelsysteem geworden om epigenetica van haploïde geslachtsbepaling, B-chromosoombiologie, gastheer-symbiontinteracties, speciatie en gifsynthese te bestuderen. Ondanks de beschikbaarheid van verschillende moleculaire hulpmiddelen, waaronder CRISPR/Cas9, zijn functionele genetische studies nog steeds beperkt in dit organisme. De belangrijkste beperking van het toepassen van CRISPR/Cas9-technologie in N. vitripennis komt voort uit de uitdagingen van embryonale micro-invoegingen. Injecties van embryo’s zijn bijzonder moeilijk in dit organisme en in het algemeen bij veel parasitoïde wespen, vanwege de kleine embryogrootte en de vereiste van een gastheerpop voor embryonale ontwikkeling. Om deze uitdagingen aan te pakken, werd cas9 ribonucleoproteïne complexe levering in vrouwelijke eierstokken door injectie bij volwassenen, in plaats van embryonale micro-injectie, geoptimaliseerd, wat resulteerde in zowel somatische als erfelijke kiembaanbewerkingen. De injectieprocedures werden geoptimaliseerd bij poppen en vrouwelijke wespen met behulp van ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) of BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). Deze methoden blijken effectieve alternatieven te zijn voor embryo-injectie, waardoor plaatsspecifieke en erfelijke kiembaanmutaties mogelijk zijn.
Introduction
CRISPR/Cas9 genbewerking is een krachtige technologie voor functionele genetische studies, vooral in veel opkomende modelorganismen zoals de juweelwesp, Nasonia vitripennis. Het gemak van opfokken en de beschikbaarheid van een compleet genoom maakt de juweelwesp een belangrijk experimenteel systeem voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen van verschillende biologische processen. N. vitripennis is bijvoorbeeld onlangs gebruikt om de epigenetische basis van het haploïde geslachtsbepalingssysteem1,2,de biologie van B-chromosomen 3 ,4,5,6en de genetische basis voor circadiane en seizoensgebonden regulatie7,8teontrafelen . Enkele van de kenmerken die N. vitripennis vatbaar maken om mee te werken, zijn korte generatietijd (~ 2 weken bij 25 °C), hoge reproductiesnelheden, gemakkelijke geslachtsscheiding in het popstadium en de mogelijkheid om stammen bij 4 °C te diapause en op te slaan. De levenscyclus begint met vrouwelijke wespen die de poppen van de blaasvlieg parasiteren, Sarcophaga bullata. Via hun legboor leggen vrouwtjes tot 50 eieren in het popgeval van de blaasvlieg. Eieren ontwikkelen zich tot larven die zich voeden met de S. bullata-pop, zich de komende dagen blijven ontwikkelen en vervolgens verpoppen, gevolgd door volwassen eclosie en opkomst uit het gastheerpoppenarium9.
Moleculaire instrumenten voor het uitvoeren van functionele genetische studies in N. vitripennis, zoals RNA-interferentie (RNAi)10 en CRISPR/Cas911,12, zijn beschikbaar, maar zijn beperkt, voornamelijk als gevolg van problemen bij het uitvoeren van embryonale micro-invoegsels13. Omdat N. vitripennis-eieren een popgastheer nodig hebben voor ontwikkeling, is eimanipulatie zeer uitdagend. Embryo’s in het pre-blastodermstadium moeten worden verzameld bij de blaasvliegpoppen van de gastheer, snel micro-geïnjecteerd en onmiddellijk worden overgebracht naar de gastheer voor ontwikkeling13. Deze stappen vereisen precisie en gespecialiseerde training om te voorkomen dat de micro-geïnjecteerde embryo’s of de pop gastheren13beschadigen. Bovendien zijn de eieren erg klein en fragiel, vooral na micro-invoegingen, met een zeer stroperig cytoplasma dat een continue verstopping van de injectienaald veroorzaakt13. Deze kenmerken maken embryonale micro-injections uitzonderlijk uitdagend, waarvoor hoogopgeleide operators en gespecialiseerde apparatuur nodig zijn die in de meeste N. vitripennis-laboratoria ontbreekt.
De optimalisatie van alternatieve injectiemethoden voor de levering van CRISPR-reagentia zou bijdragen tot de consolidatie van N. vitripennis als modelorganisme. De manipulatie van poppen en volwassenen is minder uitdagend dan het manipuleren van embryo’s en kan worden bereikt met een basisinjectieopstelling. Hier worden twee protocollen beschreven voor injectie van poppen en volwassenen: één met gespecialiseerde apparatuur voor injecties en de andere met behulp van een aspiratorbuisassemblage uitgerust met een glazen capillaire naald. Het gebruik van een aspiratorbuis is bijzonder geschikt voor laboratoria die geen toegang hebben tot gespecialiseerde apparatuur voor embryomicro-insecties. Efficiënte injecties van verschillende ontwikkelingsstadia van N. vitripennis, waaronder witte of zwarte poppen en volwassen wespen, worden aangetoond. Wespen in het witte popstadium zijn bijzonder geschikt voor RNAi-gemedieerde knockdown-experimenten. Hoewel RNAi in Nasonia voor het eerst werd beschreven door Lynch en Desplan in 200610, is er geen visuele procedure beschikbaar voor hoe RNAi-injecties worden uitgevoerd. RNAi werd onlangs gebruikt om het happloidizer-gen van het B-chromosoom PSR (Paternal Sex Ratio)3 te ontdekken en om de betrokkenheid van het klokgen, punt, in N. vitripennis biologische ritmes7te bestuderen .
Zwarte poppen en volwassen wespen kunnen worden gebruikt om CRISPR/Cas9 kiembaangenbewerking te induceren met behulp van ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) en BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules) protocollen. Deze twee eierstokafgiftemethoden zijn onlangs beschreven als effectief in Nasonia voor het genereren van kiembaanmutaties in het doelgen, cinnabar7,12. Hier is een vereenvoudigd protocol voorzien voor injecties, inclusief een visuele procedure van een stapsgewijze methodologie voor zowel pop- als volwassen injecties die kunnen worden gebruikt om functionele geneticastudies in Nasonia en waarschijnlijk bij andere parasitoïde wespen te genereren, zonder gespecialiseerde apparatuur te vereisen en embryonale micro-invoegingen te omzeilen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met het recente toegenomen gebruik van Nasonia vitripennis als modelorganisme voor verschillende biologische vragen2,3,7,17, is het nodig om injectiemethoden te ontwikkelen en te optimaliseren om een vereenvoudigd en efficiënt protocol voor de functionele analyse van N. vitripennis-genen mogelijk te maken. De huidige methoden met betrekking tot embryonale micro-injection van …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door UCSD-opstartfondsen die waren gericht op O.S.A. en NSF / BIO-subsidie 1645331 J.L.R.
Materials
| 100 x 15 mm Stackable Petri Dishes, Polystyrene, Mono, Sterile | Sigma | 960-97693-083 | |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1 mm(outside diameter) x 0.58 mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Can also use Borosilicate or Quartz |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| BAPC | phoreus biotech | BAPtofect-25 0.5 mg Kit | |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
| Dissecting needle | VWR | 10806-330 | |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Femtojet Express programmable microinjector | Eppendorf | ||
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | |
| Flesh fly pupae, Sarcophaga bullata | Ward's Science | 470180-392 | |
| Food colorant dye | |||
| Glass Test Tubes | Fisher Scientific | 982010 | |
| Glue | Elmer's | washable, no toxic school glue | |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 |
Riferimenti
- Verhulst, E. C., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Maternal control of haplodiploid sex determination in the wasp Nasonia. Science. 328 (5978), 620-623 (2010).
- Verhulst, E. C., Lynch, J. A., Bopp, D., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. A new component of the Nasonia sex determining cascade is maternally silenced and regulates transformer expression. PloS One. 8 (5), 63618 (2013).
- Dalla Benetta, E., et al. Genome elimination mediated by gene expression from a selfish chromosome. Science Advances. 6 (14), (2020).
- Aldrich, J. C., Leibholz, A., Cheema, M. S., Ausiό, J., Ferree, P. M. A “selfish” B chromosome induces genome elimination by disrupting the histone code in the jewel wasp Nasonia vitripennis. Scientific Reports. 7, 42551 (2017).
- Ferree, P. M., et al. Identification of genes uniquely expressed in the germ-line tissues of the jewel wasp Nasonnia vitripennis. G3. 3 (12), 2647-2653 (2015).
- Akbari, O. S., Antoshechkin, I., Hay, B. A., Ferree, P. M. Transcriptome profiling of Nasonia vitripennis testis reveals novel transcripts expressed from the selfish B chromosome, paternal sex ratio. G3. 3 (9), 1597-1605 (2013).
- Dalla Benetta, E., Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Adaptive differences in circadian clock gene expression patterns and photoperiodic diapause induction in Nasonia vitripennis. The American Naturalist. 193 (6), 881-896 (2019).
- Paolucci, S., et al. Latitudinal variation in circadian rhythmicity in Nasonia vitripennis. Behavioral Sciences. 9 (11), (2019).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. The parasitoid wasp Nasonia: an emerging model system with haploid male genetics. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Lynch, J. A., Desplan, C. A method for parental RNA interference in the wasp Nasonia vitripennis. Nature Protocols. 1 (1), 486-494 (2006).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 901 (2017).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo microinjection and transplantation technique for Nasonia vitripennis genome manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), (2017).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Rearing Sarcophaga bullata fly hosts for Nasonia (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Werren, J. H., Loehlin, D. W. Strain maintenance of Nasonia vitripennis (Parasitoid Wasp). Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (10), (2009).
- Beukeboom, L. W., van de Zande, L. Genetics of sex determination in the haplodiploid wasp Nasonia vitripennis (Hymenoptera: Chalcidoidea). Journal of Genetics. 89 (3), 333-339 (2010).
- Leung, K., van de Zande, L., Beukeboom, L. W. Life-history traits of the Whiting polyploid line of the parasitoid. Entomologia experimentalis et applicata. 167 (7), 655-669 (2019).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95 (7), 1017-1026 (1998).
- Yang, J., Zhao-jun, H. A. N. Efficiency of different methods for dsrna delivery in cotton bollworm (Helicoverpa armigera). Journal of Integrative Agriculture. 13 (1), 115-123 (2014).
- Brown, S., Holtzman, S., Kaufman, T., Denell, R. Characterization of the Tribolium Deformed ortholog and its ability to directly regulate Deformed target genes in the rescue of a Drosophila Deformed null mutant. Development Genes and Evolution. 209 (7), 389-398 (1999).
- Hughes, C. L., Kaufman, T. C. RNAi analysis of Deformed, proboscipedia and Sex combs reduced in the milkweed bug Oncopeltus fasciatus: novel roles for Hox genes in the hemipteran head. Development. 127 (17), 3683-3694 (2000).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Intra-abdominal injection of double-stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system. Molecular Psychiatry. 6 (6), 665-670 (2001).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Macias, V. M., et al. Cas9-mediated gene-editing in the malaria mosquito anopheles stephensi by ReMOT control. G3. 10 (4), 1353-1360 (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR/Cas9-based genome editing in the silverleaf whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Shirai, Y., Daimon, T. Mutations in cardinal are responsible for the red-1 and peach eye color mutants of the red flour beetle Tribolium castaneum. Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 372-378 (2020).
- Hunter, W. B., Gonzalez, M. T., Tomich, J. BAPC-assisted CRISPR/Cas9 system: targeted delivery into adult ovaries for heritable germline gene editing (Arthropoda: Hemiptera). bioRxiv. , 478743 (2018).
- Chaverra Rodriguez, D., Bui, M., Li, M., Raban, R., Akbari, O. Developing genetic tools to control ACP. Citrus Research Board Citrograph Magazine. 11 (1), 64-68 (2020).
