Aufbau eines einfachen und vielseitigen Beleuchtungssystems für optogenetische Experimente

Summary

Dieses Protokoll beschreibt, wie optogenetische Experimente zur Kontrolle der Genexpression mit rotem und tiefrotem Licht unter Verwendung von PhyB und PIF3 durchgeführt werden können. Enthalten sind Schritt-für-Schritt-Anleitungen für den Aufbau eines einfachen und flexiblen Beleuchtungssystems, das die Steuerung der Genexpression oder anderer Optogenetik mit einem Computer ermöglicht.

Abstract

Die Steuerung biologischer Prozesse mit Licht hat die Genauigkeit und Geschwindigkeit erhöht, mit der Forscher viele biologische Prozesse manipulieren können. Die optische Kontrolle ermöglicht eine beispiellose Fähigkeit, Funktionen zu analysieren, und birgt das Potenzial, neuartige Gentherapien zu ermöglichen. Optogenetische Experimente erfordern jedoch geeignete Lichtquellen mit räumlicher, zeitlicher oder Intensitätskontrolle, was für die Forscher oft ein Engpass darstellt. Hier erfahren Sie, wie Sie ein kostengünstiges und vielseitiges LED-Beleuchtungssystem bauen, das leicht an verschiedene verfügbare optogenetische Werkzeuge angepasst werden kann. Dieses System ist konfigurierbar für manuelle oder Computersteuerung mit einstellbarer LED-Intensität. Wir bieten eine illustrierte Schritt-für-Schritt-Anleitung für den Aufbau der Schaltung, die computergesteuerte Schaltung und den Aufbau der LEDs. Um die Montage dieses Geräts zu erleichtern, besprechen wir auch einige grundlegende Löttechniken und erklären die Schaltung, die zur Steuerung der LEDs verwendet wird. Mit unserer Open-Source-Benutzeroberfläche können Benutzer das präzise Timing und Pulsieren des Lichts auf einem PC oder einem kostengünstigen Tablet automatisieren. Diese Automatisierung macht das System nützlich für Experimente, die LEDs verwenden, um Gene, Signalwege und andere zelluläre Aktivitäten zu steuern, die sich über große Zeitskalen erstrecken. Für dieses Protokoll sind keine Vorkenntnisse in der Elektronik erforderlich, um alle benötigten Teile zu bauen oder das Beleuchtungssystem zur Durchführung optogenetischer Experimente zu verwenden.

Introduction

Optogenetische Werkzeuge werden allgegenwärtig und es werden ständig neue Technologien entwickelt, um biologische Prozesse wie Genexpression, Zellsignalisierung und vieles mehr optisch zu steuern ^1,2,3. Die Fähigkeit, zelluläre Prozesse mit Licht zu steuern, ermöglicht eine schnelle Kinetik, eine enge räumliche Kontrolle und eine dosisabhängige Regulierung, die durch Lichtintensität und Belichtungszeit gesteuert werden kann. Um diese Werkzeuge verwenden zu können, ist ein Gerät zur Steuerung dieser Parameter erforderlich. Wir haben kürzlich einen genetisch kodierten PhyB-PIF3-Genschalter für Säugetiere entwickelt, der Gene mit rotem/tiefrotem Licht reversibel aktiviert und deaktiviert^4. Dieses System wurde in mehreren Säugetierzelllinien getestet und ermöglichte die beispiellose Induktion der Genexpression auch bei sehr geringen Lichtmengen, einschließlich Lichtimpulsen. Forscher, die den PhyB-Schalter und ähnliche Werkzeuge ^5,6 verwenden möchten, fragen häufig nach Informationen über Methoden zur Steuerung der Beleuchtungsintensität und -dauer. Daher haben wir dieses Protokoll mit Schritt-für-Schritt-Anleitungen entwickelt, um eine breitere Akzeptanz dieser Werkzeuge für die Optogenetik zu ermöglichen.

Vor der weit verbreiteten Verwendung von LEDs wurden breitbandige Lichtquellen mit Filtern verwendet, um lichtempfindliche Proteine wie Phytochrome^{zu untersuchen 7}. In jüngster Zeit wurden einige LED-Beleuchtungssysteme zusammen mit optogenetischen Werkzeugen 8,9,10,11,12 veröffentlicht, aber diese Protokolle können erhebliche Fachkenntnisse in Elektronik / Software erfordern, spezielle Ausrüstung erfordern (z. B. 3D-Drucker, Laserschneidemaschinen oder Fotomasken) oder nicht die Schritt-für-Schritt-Anweisungen liefern^, die einige Forscher für ihre Forschungsbedürfnisse einsetzen müssten. Während die unabhängige Kontrolle einzelner Vertiefungen in einer Multiwell-Platte nützlich sein kann, ist sie oft unnötig, wenn Forscher nur mehrere verschiedene Proben in hellem und dunklem oder rotem Licht im Vergleich zu dunkelrotem Licht vergleichen müssen. Außerdem sind viele bestehende kommerzielle Systeme teuer und können nur eingeschränkt angepasst werden. Die in diesem Protokoll beschriebenen LEDs sind jedoch kostengünstig, hell und können auf viele Arten montiert werden. Daher können sie verwendet werden, um verschiedene Arten von Proben zu beleuchten. Mit dem mitgelieferten Protokoll und der mitgelieferten Software können LEDs im Bereich von Ultraviolett (UV) bis NIR verwendet und mit Software gesteuert werden, um optogenetische Experimente mit UVR8 13,14, Dronpa 15,16, LOV-Domänen 17,18, Step Function Opsins ^19,20, CRY2 21,22, PhyB 4,23,24 durchzuführen ^,25, bakterielle Phytochrome^26,27,28,29 und andere lichtempfindliche Systeme ^30,31,32.

Dieses Protokoll stellt ein Tutorial für den Aufbau der Schaltkreise und anderer Hardware dar, die zur Steuerung verschiedener Parameter für die Lichtstimulation benötigt werden, sowie für die molekularen / zellulären Werkzeuge zur Durchführung eines optogenetischen Experiments. Darüber hinaus berichten wir über Plasmide, die von Kyriakakis et ^al.4 optimiert wurden und für das Klonen kleiner und stabiler sind. Durch dieses Protokoll können Biologen ohne Erfahrung in Elektronik und Optik Beleuchtungssysteme bauen, die flexibel und robust sind. In einer Schritt-für-Schritt-Art zeigen wir, wie man LED-Systeme baut, um den technischen Engpass für die breitere Einführung optogenetischer Werkzeuge zu beseitigen. Dieses System kann problemlos in den meisten Zellkultur-Inkubatoren verwendet werden, auch wenn sie keine Drahtanschlüsse enthalten. Zum Beispiel haben wir das LED-System in einem befeuchteten CO₂ -Inkubator für mehr als 6 Monate kontinuierlich ohne Leistungseinbußen gehalten. Wir erklären auch, wie Sie das LED-System an einen Computer anschließen und mit Open-Source-Software verbinden, die wir auf GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces) zur Verfügung stellen. Der Aufbau eines Systems mit diesem Protokoll bietet Forschern das grundlegende Wissen, um potenzielle Probleme zu beheben, Teile zu ersetzen und Funktionalitäten zu verbessern / zu erweitern.

Systemübersicht

Der Aufbau des Beleuchtungssystems umfasst (1) den Aufbau der elektronischen Schaltung, (2) den Aufbau der Peripheriegeräte (Netzkabel, Netzschalter usw.), (3) den Aufbau der LEDs, (4) den Zusammenbau all dieser Komponenten und (5) die Installation der Software zur Steuerung der LEDs mit einer Benutzeroberfläche (Abbildung 1A). Nach der Fertigstellung kann das Beleuchtungssystem bis zu vier LEDs unabhängig voneinander über eine Benutzeroberfläche steuern (Abbildung 1B). Die Benutzeroberfläche ermöglicht es, dass jede LED in bestimmten Zeitintervallen pulsiert und nach einer bestimmten Zeit abschaltet. Es gibt auch eine Startverzögerung, um Beleuchtungsprogramme zu einem bestimmten Zeitpunkt zu starten. Potentiometer (POTs) regeln die Intensität jeder LED unabhängig voneinander oder können zur manuellen LED-Steuerung ohne Computer verwendet werden. Die Drähte zu den LEDs können beliebig lang sein, so dass sie einfach in einem Inkubator oder Laborraum platziert werden können. Aufgrund der hohen Leistung dieser LEDs können sie verwendet werden, um eine große Fläche mit einer einzigen LED aus der Ferne zu beleuchten.

Beschreibung des LED-Treibers

Um die Intensität der LEDs mit Strom zu versorgen und zu steuern, durchläuft dieses Protokoll Schritte, um einen “LED-Treiber” zu erstellen. Jede LED hat einen bestimmten Spannungsbereich, in dem sie arbeitet (Abbildung 1C). Während des Betriebs kann die Ausgangsspannung des Reglers, die die Lichtintensität steuert, über ein Potentiometer eingestellt werden. Der POT variiert den Widerstand und passt die Ausgangsspannung / Helligkeit an. Das Tuning mit einem 1kΩ (1 Kiloohm) POT ergibt das, was wir als “Hochspannungsschaltung” bezeichnen und einen Bereich von 1,35 V bis 2,9 V haben. Da 2,9 V für den Betrieb der LEDs mit niedrigerer Spannung zu hoch sind (Abbildung 1C), zeigen wir eine einzelne Modifikation (Widerstand 3 oder “R3” Zusatzabbildung 1A), die den Bereich auf die Niederspannungs-LEDs begrenzt. R3 dient dazu, die maximale Spannung, die an die LEDs angelegt wird, auf 1,85 V zu senken (Baugruppe siehe ergänzende Abbildung 8), wenn sie parallel zum Potentiometer angeordnet ist. Durch die Verwendung von Spannung zur Steuerung der Helligkeit anstelle von Strom ist das System flexibler für LEDs mit unterschiedlichen Betriebsspannungen. Abbildung 1C enthält eine Liste der Hoch- und Niederspannungs-LEDs, um die optimale Schaltungsauswahl zu unterstützen. Dieses Design hält die Mindestspannung niedrig genug, so dass die LED vollständig ausgeschaltet ist, wenn das Potentiometer ausgeschaltet ist und die Spannung nicht über die typische Betriebsspannung der LED steigt. Für die PhyB-Optogenetik verwenden wir tiefrote und tiefrote LEDs, die die Niederspannungsschaltung nutzen.

Beschreibung des LED-Computersteuerungssystems

Das LED-Beleuchtungssystem kann für eine konstante Beleuchtung ohne Computer oder Mikrocontroller verwendet werden. Für pulsierende Programme und für die Steuerung einzelner LED-Timings muss jedoch ein Mikrocontroller installiert werden. Um einen Mikrocontroller zur Steuerung der LEDs zu verwenden, wird ein Transistor benötigt, um den Mikrocontroller mit der Schaltung zu verbinden. Dieser Transistor erfasst die Spannung des Mikrocontrollers und schaltet von leitfähig oder isolierend um. Um das “Ein” und “Aus” zu steuern, verwenden wir einen sogenannten “NPN-Schalttransistor” (2N2222) als steuerbaren Shunt über R2 (ergänzende Abbildung 1A). Wenn die Spannung des Mikrocontrollers an die Transistorbasis angelegt wird, wird der Transistor leitfähig und macht die LED-Spannung niedrig, wodurch die LED ausgeschaltet wird. So werden die Ein- und Ausschaltzustände von LED und Transistor direkt vom Mikrocontroller gesteuert, der von der auf dem PC installierten Software gesteuert wird.

Für die Herstellung des Beleuchtungssystems sind die folgenden Schritte erforderlich: Bauen Sie den Stromkreis auf; Aufbau der Stromversorgung, des manuellen Netzschalters, der POTs und der Mikrocontroller-Verbindung; bauen Sie die LEDs; Platz für eine Blackbox für das Beleuchtungssystem; Schließen Sie alle Kabel und Geräte an. Installieren Sie die LED-Steuerungssoftware, stimulieren Sie die Zellen mit Licht; Messen Sie die Genexpression mit einem dualen Luciferase-Assay.

Protocol

1. Bauen Sie den Stromkreis auf HINWEIS: Das Protokoll für den Aufbau einer einzelnen Schaltung für eine verfügbare LED wird hier beschrieben. Eine Anleitung zur Erweiterung auf bis zu vier LEDs finden Sie in der Zusatzinformation. Schalten Sie den Rauchabsorber und den Lötkolben ein. Geben Sie Wasser in den Wischschwamm, halten Sie das Lot bereit.VORSICHT: Achten Sie darauf, Sicherheitsvorkehrungen zu treffen, um Rauch zu entfernen und Verbrennungen zu vermeiden. Beginnen Sie mit dem Löten von Schaltungskomponenten auf die Leiterplatte (Leiterplatte) in der Reihenfolge, die in den Zusatzfeldern angezeigt wird.HINWEIS: Verwenden Sie eine kleine Menge Lot auf der Lötkolbenspitze, um zuerst das Metall der Komponente und der Leiterplatte zu erhitzen und zusätzliches Lot direkt auf die Komponenten zu schmelzen. Flux kann sehr helfen. Lötüberbrückungsdrähte und -komponenten (ergänzende Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 3).Verwenden Sie für die Überbrückungsdrähte (die isolierte Verkabelung, die zwei Punkte auf der Leiterplatte verbindet) zwei orangefarbene [7,6 mm (0,3 Zoll)] und gelbe [12 mm (0,4 Zoll)] Drähte aus dem Jumperkit. Befestigen Sie die Leiterplatte an den “helfenden Händen” und stecken Sie die Überbrückungsdrähte in die folgenden Löcher, biegen Sie die Klemmen um 45 Grad und fügen Sie Flussmittel hinzu (Abbildung 2, ergänzende Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 3): a1 und a3 → Masse (-) (orange), a7 → Netzteil (+) #7 (gelb), d2 → d6 (gelb). Löten Sie und schneiden Sie dann die Rückseite der Drähte ab. Setzen Sie den Spannungsregler LM317T in die folgenden Lochblenden ein, biegen Sie die Stifte und fügen Sie Flussmittel hinzu (Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 4): Adj → e5, Vout → e6, Vin → e7. Löten Sie zuerst die linke und rechte Klemme, trimmen Sie sie, dann löten und trimmen Sie die mittlere Klemme. Um den Niederspannungsbereich der Schaltung einzustellen, setzen Sie einen 820-Ω-Widerstand ganz nach unten in die Lochblenden ein, löten und trimmen Sie c2 → c5 (Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 5). Um die LED-Steuerung durch den Mikrocontroller zu ermöglichen, setzen Sie den Transistor in b3–b5 ein (Abbildung 2 und ergänzende Abbildung 6): Kollektor → b3, Base → b4, Emitter → b5.HINWEIS: Achten Sie auf die Ausrichtung des Transistors, um ihn korrekt einzusetzen. Überprüfen Sie die Spezifikationen, um die Bezeichnungen Kollektor, Basis und Emitter zu finden. Löten Sie die Wire-to-Wire-Steckverbinder für den POT, die LED, den Mikrocontroller und die Stromquelle.HINWEIS: Achten Sie auf die Farbe der Drähte der Wire-to-Wire-Steckverbinder und darauf, ob Sie einen weiblichen oder männlichen Draht-an-Draht-Stecker verwenden.Stellen Sie fest, ob für die gewünschte LED eine “Niederspannungsschaltung” oder eine “Hochspannungsschaltung” erforderlich ist (Abbildung 1C).HINWEIS: Wenn sich die LED auf der Liste “Niederspannung” befindet, ist ein Widerstand parallel zum POT erforderlich. Legen Sie für die “Niederspannungs”- oder “Hochspannungs”-Schaltung den Draht von einer Kabel-an-Draht-Buchse durch das Loch a5 (ergänzende Abbildung 7). Löten Sie noch nicht ein, wenn Sie den Niederspannungskreis herstellen.HINWEIS: Drehen Sie die blanken Drahtenden so, dass die kleinen Drahthaare nicht abblättern. Wenn der Draht zu dick erscheint, um sich ohne Ausfransen durch die Lochblende zu drücken, schneiden Sie 2-6 Stränge ab und drehen Sie sie dann wieder zusammen (ergänzende Abbildung 7B-D). Wenn Sie die “Hochspannungsschaltung” herstellen, fahren Sie mit Schritt 1.4.5 fort. Wenn Sie die “Niederspannungsschaltung” herstellen, schieben Sie einen 560Ω-Widerstand durch das gleiche Loch (a5) und löten Sie mit dem Kabel-an-Draht-Stecker. Verbinden Sie das andere Ende des Widerstands mit der Masse (ergänzende Abbildung 7G). Stecken Sie das andere Ende der verlöteten Kabel-an-Draht-Buchse in ein 5-Loch, das ihn mit der Masse verbindet, und löten Sie ihn (ergänzende Abbildung 8A, B). Für den Mikrocontroller-Anschluss stecken Sie ein Ende eines Draht-an-Draht-Steckers in Bohrung a4 und das andere Ende in ein Loch, das mit dem Boden verbunden ist (ergänzende Abbildung 9A-C). Stecken Sie für den LED-Anschluss ein Ende einer Kabel-an-Draht-Buchse in die Bohrung a2 und das andere Ende in eine Bohrung, die mit der Erde verbunden ist (ergänzende Abbildung 9D, E). 2. Bauen Sie Netzteil, manuellen Netzschalter, POTs und Mikrocontroller-Anschluss Bauen Sie das Netzteil auf.Löten Sie einen orangefarbenen [7,6 mm (0,3 Zoll)] Jumper von a29 auf den Boden (ergänzende Abbildung 10). Löten Sie eine Kabel-an-Draht-Buchse von a30 an das Netzteil (+) (ergänzende Abbildung 11A–C). Löten Sie einen Draht-an-Draht-Stecker von c29 bis c30 (ergänzende Abbildung 11D-F). Schneiden Sie den Stecker von einem Netzkabel ab, legen Sie die Drähte frei, und entfernen Sie sie (ergänzende Abbildung 12A-C). Fügen Sie den Drähten vor dem Löten mit einem Flussmittelstift Flussmittel hinzu (ergänzende Abbildung 3G). Legen Sie einen 3,18 mm (1/8 Zoll) Schrumpfschlauch um einen Draht-an-Draht-Stecker und ein dickeres Stück 4,76 mm (3/16 Zoll) über das Netzteilkabel (ergänzende Abbildung 12D). Verdrehen Sie die Drähte aus dem Netzteil und dem Draht-an-Draht-Stecker zusammen, und löten Sie sie an (ergänzende Abbildung 12E, 13A, B). Legen Sie den Schrumpfschlauch mit kleinerem Durchmesser 3,18 mm (1/8 Zoll) über die Anschlüsse und schrumpfen Sie ihn mit einer Heißluftpistole (Zusatzabbildung 13C,D). Legen Sie einen Schrumpfschlauch mit größerem Durchmesser 4,76 mm (3/16 Zoll) über den kleineren Schrumpfschlauch 3,18 mm (1/8 Zoll) und erhitzen Sie ihn erneut (Zusatzabbildung 13E,F). Bauen Sie den manuellen Netzschalter.Legen Sie den Schrumpfschlauch 3,18 mm (1/8 Zoll) über die Drähte für den Schalter (ergänzende Abbildung 14A). Verdrillen und löten Sie die Drähte eines Draht-an-Draht-Steckers (ergänzende Abbildung 14B,C). Legen Sie den Schrumpfschlauch 3,18 mm (1/8 Zoll) über die gelöteten Abschnitte und schrumpfen Sie mit einer Heißluftpistole (Zusatzabbildung 14D,E). Schließen Sie den Kabel-an-Draht-Stecker an den POT an.Schleifen Sie den schwarzen Draht des Draht-an-Draht-Steckverbinders um den mittleren Anschluss des POT (ergänzende Abbildung 15B). Drehen Sie den Draht, der fest um die Klemme geschlungen ist, und löten Sie ihn (ergänzende Abbildung 15C).HINWEIS: Kleine Präzisionszangen können helfen, eine enge Drehung zu machen. Wiederholen Sie den Vorgang mit der roten Drahtverbindung zur Klemme, wie in der ergänzenden Abbildung 15D. Verwenden Sie eine Zange, um die Metalllasche in der Nähe des roten Pfeils zu brechen (ergänzende Abbildung 15E,F). Bauen Sie den Mikrocontroller-Anschluss auf (nur für computergesteuerte LEDs erforderlich).Wenn Sie einen LED-Treiber für mehr als eine LED verwenden, schneiden Sie die schwarzen Drähte von allen Kabel-an-Draht-Buchsen bis auf eine ab (ergänzende Abbildung 16A). Crimpen Sie die Enden der Draht-an-Draht-Steckverbinder, wie gezeigt (ergänzende Abbildung 16B-D). Schieben Sie die gecrimpten Enden durch den rechteckigen Stecker (ergänzende Abbildung 16E). 3. Bauen Sie die LEDs auf Entfernen Sie die Drahtenden (~ 5 mm) und tragen Sie Flussmittel mit einem Flussmittelstift auf, wie in der ergänzenden Abbildung 3G.HINWEIS: Um die Drähte effizient auf den LED-Sockel zu löten, müssen die Kontakte auf dem LED-Sockel und den Drähten mit Flussmittel versehen werden. Verzinnen Sie den Draht, indem Sie den Draht von unten erwärmen und von oben Lot hinzufügen (ergänzende Abbildung 17B). Verwenden Sie den Flussmittelstift, um den Flussmittel auf den Oberflächenkontakt des LED-Sockels zu legen (ergänzende Abbildung 17C). Legen Sie eine großzügige Menge Lot auf eine große Lötspitze (~4–5 mm) (Ergänzende Abbildung 17D) und erwärmen Sie damit den LED-Sockel am Kontakt (Ergänzende Abbildung 17E). Ziehen Sie das Lot nach einigen Sekunden über den Kontakt (ergänzende Abbildung 17F). Wiederholen Sie die Schritte 3.3 bis 3.4 für den anderen Kontakt (ergänzende Abbildung 17G).ACHTUNG: Der LED-Sockel kann beim Löten sehr heiß werden. Platzieren Sie den LED-Sockel auf einer Oberfläche, die nicht schmilzt oder brennt. Befestigen Sie den schwarzen Draht mit den Haarspangen auf den Kontakt “C+” (Kathode) (Zusatzabbildung 18A). Legen Sie eine großzügige Menge Lot auf die große Lötspitze (Ergänzende Abbildung 18B) und drücken Sie sie auf den Draht, bis das Lot auf dem LED-Sockel schmilzt (Ergänzende Abbildung 18C). Halten Sie den Draht fest (Ergänzende Abbildung 18D) und entfernen Sie den Lötkolben, während Sie den Draht an Ort und Stelle halten (Ergänzende Abbildung 18E). Legen Sie eine kleine Menge Lötpaste auf die Pads für die LED-Anschlüsse (Zusatzabbildung 19A,B) und legen Sie die LED mit einer Pinzette über die Pads (Zusatzabbildung 19C).HINWEIS: Wenn die Platzierung etwas abweicht, ist es in Ordnung. Es wird an Ort und Stelle gehen, sobald die Lötpaste schmilzt. Halten Sie den roten Draht an der “A+” (Anode) fest und befestigen Sie ihn mit einer Haarspange (Zusatzabbildung 20A–C). Legen Sie eine großzügige Menge Lot auf die große Lötspitze (Ergänzungsbild 20D) und drücken Sie sie auf den Draht, bis das Lot auf dem LED-Sockel und die Lötpaste unter der LED schmelzen (Ergänzende Abbildung 20E).HINWEIS: Nachdem die Lotpaste geschmolzen ist, wird die Farbe silbern (ergänzende Abbildung 20H,I). Wählen Sie die Länge des Drahtes, der für den gewünschten Aufbau benötigt wird. Entfernen Sie die LED-Drähte und einen Draht-an-Draht-Stecker (ergänzende Abbildung 21A) und fügen Sie dann Flussmittel hinzu wie in der ergänzenden Abbildung 3G. Legen Sie den Schrumpfschlauch über die Drähte. Verwenden Sie einen 3,18 mm (1/8 Zoll) Schrumpfschlauch über den Draht-an-Draht-Steckverbindern und einen 4,76 mm (3/16 Zoll) Schrumpfschlauch über dem Draht (ergänzende Abbildung 21B). Clippen Sie den Draht-an-Draht-Steckverbinder mit einer “helfenden Hand” und drehen Sie das Steckerende mit dem Draht (ergänzende Abbildung 21C) und löten Sie sie. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem anderen Draht (ergänzende Abbildung 21D,E). Legen Sie die 3,18 mm (1/8 Zoll) Schrumpfschläuche über das Lot und schrumpfen Sie (ergänzende Abbildung 21F-G). Legen Sie den 4,76 mm (3/16 Zoll) Schrumpfschlauch über den 3,18 mm (1/8 Zoll) Schrumpfschlauch und schrumpfen Sie (ergänzende Abbildung 21H–I). Befestigen Sie die LED-Drähte der “helfenden Hände” mit Klebeband darunter (ergänzende Abbildung 22A). Epoxidharz gemäß den Anweisungen des Herstellers mischen und auf der Oberseite der gelöteten LED verteilen (ergänzende Abbildung 22B). Über Nacht ruhen lassen, um zu heilen. Wenn Sie mit einem Touch-Verschluss montiert werden, schneiden Sie ein kleines Stück des Touch-Verschlusses ab (ergänzende Abbildung 23A) und drücken Sie es 30 s lang gegen die Rückseite der LED. Verwenden Sie ein Hochgeschwindigkeits-Rotationswerkzeug, um eine Kerbe auf dem Deckel eines schwarzen Kastens zu machen (ergänzende Abbildung 23C-E). Bauen Sie eine Halterung für eine einzelne LED durch eine Sichtschutzfolie.Bohren Sie mit dem Spatenbohrer ein 1,75 cm (11/16 Zoll) langes Loch durch die Oberseite eines schwarzen Kastens, in dem die LED platziert wird (ergänzende Abbildung 24A). Machen Sie mit einem Hochgeschwindigkeits-Drehwerkzeug eine Kerbe auf einer Seite des Lochs, um Platz für den LED-Draht zu schaffen, wie in der ergänzenden Abbildung 24A gezeigt. Schneiden Sie ein Stück Sichtschutzfolie (25–30 mm) und kleben Sie es auf die Innenseite des schwarzen Kastens, der das Loch abdeckt, durch das die LED leuchtet (ergänzende Abbildung 24A). Platzieren Sie die LED außerhalb des schwarzen Kastens mit Sichtschutzfolie und Klebeband mit Klebeband auf dem Loch (ergänzende Abbildung 24B–E). 4. Nehmen Sie eine Blackbox für das Beleuchtungssystem auf Bohren Sie bei einem System mit vier LEDs vier 0,83 cm (21/64 Zoll) große Löcher in den Deckel in einem Abstand von 3,81 cm (1,5 Zoll), an denen die Potentiometer angebracht werden (ergänzende Abbildung 25). Schneiden Sie mit einem Hochgeschwindigkeits-Rotationswerkzeug ein rechteckiges Loch von 1,19 cm x 1,90 cm (0,47 Zoll x 0,75 Zoll) in die linke obere Ecke (ergänzende Abbildung 25). Bohren Sie mit dem Spatenbohrer ein 1,75 cm (11/16 Zoll) langes Loch in den schwarzen Kasten (ergänzende Abbildung 26). Feilen Sie die Löcher und führen Sie die Tülle in das eingebohrte Loch ein (ergänzende Abbildung 26). Für die computergesteuerten LEDs schleifen Sie den Bereich, in dem der Mikrocontroller in eine Blackbox geklebt wird, sowie die Unterseite des Mikrocontrollerhalters. Befestigen Sie den Mikrocontroller an der Halterung, bevor Sie die Halterung in der schwarzen Box befestigen und dann mit Epoxidharz versehen (ergänzende Abbildung 27A). Verwenden Sie Schleifpapier, um die Unterseite von zwei Clips und den Bereich in einem schwarzen Kasten zu schleifen, in dem der Stromkreis platziert werden soll, und befestigen Sie die Clips in der schwarzen Box mit dem Epoxidharz (ergänzende Abbildung 27A). Befestigen Sie die Leiterplatte in Clips (ergänzende Abbildung 27B). Drücken Sie den Netzschalter durch das quadratische Loch im Deckel in der Zusatzfigur 25 und schnappen Sie ihn ein (Zusatzabbildung 28A). Drücken Sie die POTs durch die Löcher auf dem Deckel, schrauben Sie sie fest (ergänzende Abbildung 28A) und setzen Sie den Knopf auf den POT (ergänzende Abbildung 28B). 5. Schließen Sie alle Kabel und Geräte an Beschriften Sie die Draht-an-Kabel-Steckverbinder (z. B. LED, POT, COM) (ergänzende Abbildung 29A). Die in Schritt 2.4 (ergänzende Abbildung 16) hergestellten gecrimpten Steckverbinder werden an den Draht-an-Draht-Stecker zwischen den beiden Buchsen (POT und LED) angeschlossen (ergänzende Abbildungen 7A und S37). Schließen Sie die gecrimpten Enden an den Mikrocontroller an (ergänzende Abbildung 30). Ziehen Sie das USB-Kabel durch die Tülle und stecken Sie es in den Mikrocontroller. Ziehen Sie die Drähte für die LEDs durch die Tülle und verbinden Sie sie mit der Kabel-an-Draht-Buchse links neben dem Mikrocontroller-Anschluss (Zusatzabbildungen 9D und 38). Ziehen Sie den Draht für die Stromversorgung durch die Tülle und verbinden Sie ihn mit dem Draht-an-Draht-Stecker auf der rechten Seite der Leiterplatte (ergänzende Abbildung 11D). Verbinden Sie den Kabel-an-Kabel-Stecker vom Netzschalter mit dem Kabel-an-Kabel-Buchse auf der rechten Seite der Leiterplatte (ergänzende Abbildung 11A). Verbinden Sie die Draht-an-Draht-Stecker von den POTs auf dem Deckel mit den Kabel-an-Draht-Buchsen auf der Leiterplatte (ergänzende Abbildungen 8 und 36).HINWEIS: Schalten Sie den Stromkreis nicht ein, ohne dass die Potentiometer angeschlossen sind. 6. Installieren Sie die LED-Steuerungssoftware HINWEIS: Weitere Informationen finden Sie in den ausführlichen Software-Installationsanweisungen in der ergänzenden Datei auf Github. https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces Laden Sie die Software für die Programmierung des Mikrocontrollers herunter und installieren Sie sie. Laden Sie den Paketmanager herunter und installieren Sie ihn. Programmieren Sie den Mikrocontroller. Laden Sie die Runtime-Engine herunter, und installieren Sie sie. Laden Sie die Benutzeroberfläche herunter. 7. Stimulieren Sie die Zellen mit Licht Transfizieren Sie HEK293-Zellen.Platte HEK293 Zellen mit 100k Zellen pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte. Verwenden Sie die Beispieltabelle, um serumfreie Medien, Polyethylenimin (PEI) und DNA-Volumina (ergänzende Abbildung 39) zu berechnen und anhand des Herstellerprotokolls zu transfizieren. Stimulation der Zellen mit Licht.HINWEIS: Die Zellen müssen nach der Transfektion im Dunkeln gehalten oder mit einer Lichtquelle behandelt werden, die das optogenetische System nicht anregt.Entscheiden Sie, welche Art von Stimulation auf die Zellen angewendet werden soll (kontinuierliches Licht, pulsierende Intensität usw.). Schalten Sie die LED-Stromversorgung ein, während die POTs ausgeschaltet sind (gegen den Uhrzeigersinn). Platzieren Sie einen Belichtungsmesser in der schwarzen Box, in der die Zellen platziert werden, und platzieren Sie den Deckel mit der LED über dem Messgerät. Passen Sie die Lichtintensität nach Bedarf an. Wenn Sie den Computer zur Steuerung der LEDs verwenden, öffnen Sie die Benutzeroberflächensoftware. Programmieren Sie die Benutzeroberfläche (Abbildung 5A, B).Wählen Sie oben links den COM-Port für den Mikrocontroller aus und klicken Sie auf Verbinden. Verwenden Sie die Panels auf der rechten Seite, um jede LED zu programmieren. Wählen Sie für Dauerlicht eine beliebige Zeit außer Null in der “Zeit ein” und stellen Sie die “Zeit aus” auf Null. Programmieren Sie unten rechts die Hauptsteuerung für das Timing.Um die Beleuchtung zu verzögern, wählen Sie eine Startverzögerung (HH:MM). Um alle LEDs nach einer bestimmten Zeit auszuschalten, wählen Sie eine Laufzeit (HH:MM) aus. Starten Sie das Beleuchtungsprogramm mit einem Klick auf die Schaltfläche Ausführen (Abbildung 5A). 8. Messung der Genexpression mit einem dualen Luciferase-Assay Bereiten Sie Luciferase-Reagenz vor, indem Sie 10 ml Luciferase-Puffer mit Luciferase-Reagenz und Aliquot in 1-ml-Röhrchen mischen, die bis zu 1 Jahr bei -80 °C gelagert werden. Lysepuffer 5x in 1x für 100 μL für N + 2 Wells vorbereiten. z.B. für 30 Proben 30 x 20 μL 5X Lysepuffer und 30 x 80 μL MQH2O. Renilla-Substratlösung vorbereiten: 20 μL Renilla-Substrat für 1 ml Renilla-Puffer (diese Menge ist für 10 Assays geeignet). Entfernen Sie die Zellen aus dem Inkubator, saugen Sie das Medium ab, fügen Sie 100 μL 1x Lysepuffer pro Vertiefung hinzu und legen Sie es für 15 min auf einen Shaker bei 100 U/min. Bei -20 °C für mindestens 1 h aufbewahren. Geben Sie 100 μL Luciferase-Reagenz pro Probe in eine Vertiefung einer weißen 96-Well-Platte. Stellen Sie den Plattenleser für Lumineszenz ein. Stellen Sie mit dem Luminometermodul des Plattenlesers die Integration auf 1 s ein. Geben Sie aufgetaute Lysate in Vertiefungen unterhalb des Luciferase-Reagenzes hinzu. Mischen Sie mit einer Mehrkanalpipette 20 μl Probe in das Luciferase-Reagenz und messen Sie sofort die Lumineszenz. Fügen Sie nach dem Messwertplateau 100 μl Renilla-Substratlösung hinzu und scannen Sie erneut. Teilen Sie das Luciferase-Signal durch das Renilla-Signal, um die Transfektionseffizienz zu berücksichtigen. Vergleichen Sie Luciferase-Signale, die auf Transfektionseffizienz normiert sind (vergleichen Sie z. B. das Signal von rot beleuchteten und tiefrot beleuchteten Proben).

Representative Results

Sobald der Stromkreis, das Netzteil, der Netzschalter, die POTs und eine LED montiert sind (bis zur ergänzenden Abbildung 21), kann die Schaltung getestet werden. Wenn alle POTs vorhanden sind, steuert der POT die LED-Intensität. Sobald die Montage bis zur ergänzenden Abbildung 29 abgeschlossen ist, kann das System manuell für die Optogenetik oder andere Anwendungen verwendet werden. Die gesamte Systemleistung kann manuell mit dem Netzschalter gesteuert werden. Die Intensität jeder LED kann unabhängig voneinander über den an jeden Stromkreis angeschlossenen POT gesteuert werden. Nach der Installation der Software und der Programmierung des Mikrocontrollers kann die Benutzeroberfläche mit dem Mikrocontroller kommunizieren. Mit der Benutzeroberfläche können die LEDs auf verschiedene Arten zeitlich gesteuert werden: (1) jede LED kann so programmiert werden, dass sie für eine bestimmte Zeit eingeschaltet bleibt, (2) jede LED kann so programmiert werden, dass sie pulsiert, (3) eine globale Startverzögerung (z. B. beim Transfizieren und Leuchten 24 Stunden später) kann programmiert werden (Abbildung 6B), (4) die Gesamtzeit, die das Programm nach der Verzögerung laufen soll. Es gibt zwei Benutzeroberflächen, eine mit größeren Tasten zur gleichzeitigen Steuerung von zwei LEDs und eine weitere mit vier LEDs (Abbildung 5A, B). Die zwei-LED-Benutzeroberfläche ist für Tablets optimiert und reicht für viele Experimente aus, um rote und tiefrote LEDs anzusteuern. Für größere Experimente können über die zweite Benutzeroberfläche bis zu vier LEDs angesteuert werden. Bei der Induktion der Genexpression hängt das erwartete Ergebnis von mehreren Parametern ab. Dazu gehören die Induktionszeit, die Induktionsstufen (z. B. die Lichtmenge oder das Medikament) und die Kopienzahl des induzierbaren Konstrukts in der Zelle. Um dies zu zeigen, transfizierten wir den PhyB-Genschalter zusammen mit unterschiedlichen Mengen an Reporter-DNA (pPK-202) (0,5 %, 1 %, 2 %, 4 % und 8 % der transfizierten DNA) (Abbildung 6A) und beleuchteten sie wie in Abbildung 6B gezeigt. In Proben, die PhyB enthalten, aber kein Plasmid zur Herstellung von Phycocyanobilin (PCB-Chromophor) (d.h. nicht lichtempfindlich), steigt die Luciferase-Genexpression/-leckage mit der Menge an Reporter-DNA (Abbildung 6C) (Dunkelrotes P < 0,0001, lineare Regression gefolgt von einem Wald-Test) (Rotes P < 0,0001, lineare Regression gefolgt von einem Wald-Test). Wenn der gesamte PhyB-Genschalter, einschließlich des PCB-Chromophors produzierenden Plasmids (lichtempfindliche Zellen), für dunkelrotes Licht beleuchtet wird, steigt auch die Luciferase-Expression mit zunehmender Reporter-Konstruktmenge im Transfektionsmix (Abbildung 6C, D) (Dunkelrotes Licht P < 0,0001, Lineare Regression gefolgt von einem Wald-Test). Wenn die lichtempfindlichen Zellen mit rotem Licht beleuchtet werden, steigt auch die Luciferase-Expression mit zunehmender Reportermenge (P < 0,0001, lineare Regression gefolgt von einem Wald-Test). Beim Vergleich der Induktionsniveaus der mit Rotlicht behandelten Zellen mit denen der mit tiefem Rotlicht behandelten Zellen fanden wir eine leichte Abnahme der Faltenaktivierung mit zunehmender Reportermenge (Abbildung 6E) (P = 0,0141, Lineare Regression gefolgt von einem Wald-Test). Abbildung 1: Eine Grundschaltung für eine einzelne LED. (A) Ein Flussdiagramm mit einem Überblick über die Schritte, die zum Bau des LED-Beleuchtungssystems erforderlich sind. (B) Das Steuerungssystem für die LED-Beleuchtung. (links) Steuerbox zur Regulierung der LED-Intensität und des Timings. (Mitte) Eine PC-Tablet-Benutzeroberfläche zur Steuerung von LEDs. (rechts) Eine Blackbox für die Montage von LEDs und die Platzierung von Zellen für die optische Stimulation. (C) Tabelle zur Bestimmung, ob die LED einen Hoch- oder Niederspannungskreis benötigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: Anleitung zum Einlöten der Bauteile. (A) Ein Beispiel für die Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Aufbau der Schaltung. (B,C) Beispielanleitung mit Bildern des zu montierenden Geräts. (D) Beispielanweisungen für die gleichzeitige Montage mehrerer Stromkreise. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 3: Ansichten eines montierten LED-Steuerungssystems. (A) Außenansicht des zusammengebauten Systems. (B) Innenansicht eines zusammengebauten Beleuchtungssystems mit vier LEDs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 4: Anleitung zum Reflow-Löten der LED auf den Kühlkörper. (A) Der LED-Sockel und eine Nahaufnahme einer tiefroten LED. (B) Platzieren von Lötpaste auf dem LED-Sockel. (C) Bild einer gelöteten LED. Rote Pfeile zeigen auf Lötpads. Im Vergleich zu Grau vor dem Löten (A) erscheint das Lot nach dem Löten metallisch/glänzend. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 5: Software zur Steuerung optogenetischer Experimente. (A) Eine Zwei-LED-Benutzeroberfläche mit großen Tasten für die einfache Bedienung mit einem preiswerten Tablet. (B) Eine Benutzeroberfläche mit vier LEDs. Beide Schnittstellen ermöglichen eine unabhängige LED-Steuerung. Für das Pulsieren können LEDs so programmiert werden, dass sie für bestimmte Pulsbreiten und bestimmte Laufzeiten ein- und ausgeschaltet werden. Das Pulsieren kann auch eine Startverzögerung und eine vorgegebene Gesamtlaufzeit haben. (C) Die LED-Steuertablette, die auf einem Zellkulturinkubator montiert ist. (D) Illustration des PhyB-Gensystems bei Beleuchtung mit tiefrotem Licht. Dunkelrotes Licht hält das Gen im “ausgeschalteten” oder “dunklen” Zustand. (E) Illustration des PhyB-Gensystems bei roter Beleuchtung. Rotes Licht induziert die Genexpression, indem es die Interaktion zwischen PhyB und PIF3 fördert. Diese Interaktion lokalisiert die Genaktivierungsdomäne (AD), die mit PIF3 fusioniert ist, mit dem UAS-Promotor, wodurch das Reportergen aktiviert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 6: Erwartete Ergebnisse mit dem LED-System zur Steuerung von PhyB. (A) Ein Plasmid, das für PhyB+PIF3-Zwei-Hybrid-Partner kodiert (pPK-351), ein Plasmid, das für Phycocyanobilin (PCB-Chromophor)-Syntheseenzyme kodiert (pPK-352), und ein Luciferase-Reporter-Plasmid (pPK-202). (B) Zeitleiste der Lichtinduktionsexperimente für C-E. (C) Basale Transkriptionswerte (AKA-Undichtigkeit) mit zunehmenden Mengen an Reporter-DNA. “Leck”-Proben werden nicht mit pPK-352 transfiziert (d.h. sie reagieren nicht auf Licht), sondern werden mit rotem oder tiefrotem Licht beleuchtet. Lichtschalterproben (LS) umfassen alle Licht-Gen-Schalter-Plasmide und werden mit rotem oder tiefrotem Licht beleuchtet. (D) Lichtinduktionspegel als Reaktion auf rotes und dunkelrotes Licht. (LS-Dunkelrotes Licht sind die gleichen Daten in C und D.) (E) Falteninduktion von Luciferase in Zellen, die mit rotem Licht/tiefrotem Licht beleuchtet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.  Bitte klicken Sie hier, um die ergänzenden Abbildungen 1-39 herunterzuladen. Ergänzende Abbildung 1: Elektronische Treiberschaltung für mehrere LEDs. (A) Schaltplan für ein einzelnes LED-System. (B) Schaltplan für ein System mit vier LEDs. Ergänzende Abbildung 2: Platzierung der Schaltung Verbindungen. (A) Befestigen Sie Ihre Leiterplatte an Ihren helfenden Händen. (B) Position der Hauptstromkreis-Jumper in die Durchgangslöcher im Bild. (C) Diagramm der Drahtverbinder, die die Koordinaten abbilden. Zeichnen Sie für die vier LED-Systeme Linien, die jeden Stromkreis wie gezeigt trennen (schwarze vertikale Linien). Die ergänzenden Abbildungen 31–38 beschreiben den gleichzeitigen Aufbau von vier Stromkreisen. Ergänzende Abbildung 3: Löten der Drähte auf die Leiterplatte. (A) Biegen Sie die Jumper so, dass sie direkten Kontakt mit der Leiterplatte haben und während des Lötens an Ort und Stelle bleiben. (B) Eine weitere Ansicht der gebogenen Drähte. (C) Drähte nach dem Löten. (D) Beschnittene Drähte auf der Leiterplatte. (E) Geschrumpfte Isolierung nach dem Erhitzen mit Lot. (F) Verschieben der Isolierung in Position, um das Erddurchgangsloch abzudecken (blauer Pfeil) (G) Hinzufügen von Flussmittel zu einem Drahtende oder einer Klemme. Ergänzende Abbildung 4: Einlöten des Spannungsreglers. (A) Karte der Koordinaten des Spannungsreglers. (B) Platzierung des Spannungsreglers. (C) Gebogene Spannungsreglerleitungen. (D) Spannungsreglerklemmen nach dem Löten. Ergänzende Abbildung 5: Einlöten des R1-Widerstandes. (A) Karte der Koordinaten des Widerstands R1 (820 Ω). (B) Durchziehen des Widerstands durch die Leitung mit einer Zange (C) Der gezogene Widerstand in der Nähe der Leiterplatte. (D) Der gelötete Widerstand in der Nähe der Leiterplatte. Ergänzende Abbildung 6: Einlöten des Transistors. (A) Karte der Transistorkoordinaten und -ausrichtung. (B) Beachten Sie die Ausrichtung des Transistors; Das Etikett in diesem Modell ist dem Spannungsregler (LM317T) zugewandt. Überprüfen Sie die Spezifikation des Transistors, um sicherzustellen, dass sich “Emitter”, “Base” und “Collector” in den richtigen Löchern befinden. (C) Der Transistor mit den vor dem Löten gebogenen Anschlüssen. Ergänzende Abbildung 7: Einlöten des Draht-an-Draht-Steckers für das Potentiometer (plus eines 560Ω-Widerstands für den Niederspannungsstromkreis). (A) Karte der Koordinaten des Draht-an-Draht-Steckverbinders (zuzüglich des R3-560Ω, wenn der Niederspannungskreis gebaut wird, wird der Draht-an-Draht-Steckverbinder in das Loch vor dem Widerstand gelegt). (B) Eine Kabel-an-Draht-Buchse. (C) Um den Einbau des Widerstands und des Draht-an-Draht-Steckers in die Durchgangsbohrung zu erleichtern, werden 3-5 Litzen des geflochtenen Drahtes gebogen. (D) Die Litzen werden mit Drahtschneidern so nah wie möglich an der Isolierung abgeschnitten. (E) Roter Draht einer Draht-an-Draht-Buchse durch das A5-Durchgangsloch eingeführt (für den Niederspannungsstromkreis R3 durch das gleiche Durchgangsloch). (F) Unterseite des Widerstands und des Draht-an-Draht-Steckers vor dem Löten. (G) Bild des gelöteten R3-Widerstandes, der mit der Masse verbunden ist (F = Buchse). Ergänzende Abbildung 8: Löten des Draht-an-Draht-Steckers für das Potentiometer an die Erde. (A) Karte der Koordinaten der Masseverbindung für den Draht-an-Draht-Steckverbinder des Potentiometers. (B) Draufsicht auf den Draht-an-Draht-Steckverbinder des Potentiometers parallel zu R3 (F = Buchse). Ergänzende Abbildung 9: Löten des Mikrocontrollers und der LED-Wire-to-Wire-Steckverbinder. (A) Karte der Koordinaten des Draht-an-Draht-Steckverbinders für die Verbindung des 2N222A und der Masse mit dem Mikrocontroller. (B) Gelöteter Draht-an-Draht-Stecker. (C) Draufsicht auf (B). (D) Karte der Koordinaten der Kabel-an-Draht-Buchse für den Anschluss des Stromkreiseingangs und der Masse an die LED. (E) Gelötete Kabel-an-Draht-Buchse (F = Buchse, M = Stecker). Ergänzende Abbildung 10: Löten des Jumpers für die Stromversorgungsschaltung. (A) Karte der Koordinaten des orangefarbenen Jumpers zum Anschließen der Stromversorgung an den Boden. (B) Der orangefarbene Jumper ist verlötet. (C) Die Unterseite des eingelöteten Jumpers. Ergänzende Abbildung 11: Löten des Netzschalters und der Draht-an-Kabel-Steckverbinder der Stromquelle. (A) Karte der Koordinaten der Kabel-an-Draht-Buchse zum Anschließen des Netzschalters. (B) Die Kabel-an-Draht-Buchse ist an Ort und Stelle verlötet. (C) Eine andere Sichtweise von (B). (D) Karte der Koordinaten des Draht-an-Draht-Steckers zum Anschließen der Stromquelle. (E) Gelöteter Draht-an-Draht-Stecker. (F) Eine andere Ansicht von (E) (F = weiblich, M = männlich). Ergänzende Abbildung 12: Anschließen des Netzteils an einen Kabel-an-Draht-Stecker. (A) Das unveränderte Netzteil. (B) Abschneiden der Stromversorgungsleitungen. (C) Die Netzteilkabel sind abisoliert und mit überschüssiger Isolierung abgeschnitten. (D) Platzierung des Schrumpfschlauchs um die Stromversorgungsdrähte. Schläuche, die die beiden Verbindungen trennen (rote Pfeile) und Schläuche, um die getrennten Drähte zu halten (gelber Pfeil). (E) Verdrillte Drähte, die das Netzteil mit dem Kabel-an-Draht-Buchse verbinden. Ergänzende Abbildung 13: Löten und Isolieren des Netzteilanschlusses an einen Draht-an-Draht-Stecker. (A) Die gelötete Verbindung zwischen der Masse der Stromversorgung und einer Kabel-an-Draht-Buchse. (B) Die Lötverbindung zwischen dem Pluspol des Netzteils und einer Kabel-an-Draht-Buchse. (C) Schrumpfschlauch über die verlöteten Einzelanschlüsse gezogen (roter Pfeil). (D) Beide Netzteilanschlüsse verlötet und mit wärmebehandeltem Schrumpfschlauch. (E) Platzierung des Schrumpfschlauchs über den einzelnen Anschlüssen (gelber Pfeil). (F) Vollständiges Netzteil. Ergänzende Abbildung 14: Löten des Netzschalters an einen Draht-an-Draht-Stecker. (A) Netzschalter mit abisolierten Drähten und Schrumpfschlauch über den Drähten (rote Pfeile). (B) Drähte, die den Schalter und den Draht-an-Draht-Stecker verbinden, werden vor dem Löten miteinander verdrillt. (C) Platzieren des Schrumpfschlauchs über den Lötverbindungen. (D) Anschlüsse, die mit dem wärmebehandelten Schrumpfschlauch abgedeckt sind. (E) Ein Netzschalter, der mit einem Draht-an-Kabel-Stecker ausgestattet ist. Ergänzende Abbildung 15: Verdrahtung eines Potentiometers mit einem Draht-an-Draht-Stecker. (A) Die Potentiometerteile. (B) Ein Draht-an-Draht-Stecker, der verdreht und gebogen ist, um den mittleren Anschluss des Potentiometers einzuhaken. (C) Ein männlicher Draht-an-Draht-Stecker, der um den mittleren Anschluss des Potentiometers gedreht ist. (D) Gelötete Draht-an-Draht-Verbindungen. (E) Roter Pfeil, der vor dem Entfernen auf die Metalllasche zeigt. (F) Das Potentiometer nach dem Entfernen der Metalllasche. Ergänzende Abbildung 16: Verdrahtung der Mikrocontroller-Verbindung. (A) Drähte für Kabel-an-Draht-Buchsen, die zur Vorbereitung des Crimpens abisoliert und geschnitten werden. (B) Platzierung des Crimps auf dem Draht-an-Draht-Steckverbinder. (C) Crimpen des Draht-an-Draht-Steckverbinders. (D) Gecrimpter Draht-an-Draht-Stecker. (E) Vollständig montierter Mikrocontroller-Anschluss. Ergänzende Abbildung 17: Lötdrähte und LED auf den LED-Sockel Teil 1. (A) Materialien, die benötigt werden, um die LED an den LED-Sockel zu löten. (B) Verzinnung der Spitze des abisolierten Drahtes. (C) Anlegen von Flussmittel auf den Kontakt des LED-Sockels. (D) Hinzufügen von Lötmittel zu der großen Lötspitze, um den LED-Sockel zu verzinnen. (E) Platzieren des Lötmittels auf dem Kontakt, um den LED-Sockel zu erwärmen. (F) Der LED-Sockel nach dem Ziehen der Lötspitze über den Kontakt. (G) Dasselbe Verfahren bei dem anderen Kontakt. Ergänzende Abbildung 18: Lötdrähte und LED auf den LED-Sockel Teil 2. (A) Ein verzinnter Draht, der mit einer Haarspange an den Kontakt geclippt wird. Beachten Sie, dass der schwarze Draht an die Kathode “C-” gelötet ist. (B) Zugabe einer großzügigen Menge Lot zur Lötspitze. (C) Die Lötspitze drückt auf den Draht und schmilzt das Lot auf der LED-Basis und dem Draht. (D) Halten Sie den Draht so fest, dass er an Ort und Stelle bleibt, wenn der Lötkolben entfernt wird. (E) Halten Sie den Draht an Ort und Stelle, bis das Lot aushärtet. Ergänzende Abbildung 19: Lötdrähte und LED auf den LED-Sockel Teil 3. (A) Verwenden Sie eine scharfe Spitze, um Lötpaste auf den LED-Sockel zu legen, um die LED zu montieren. (B) Der LED-Sockel mit der Lötpaste. (C) Platzierung der LED auf dem LED-Sockel so, dass die Kontakte der LED und des LED-Sockels übereinstimmen. Ergänzende Abbildung 20: Lötdrähte und LED auf den LED-Sockel Teil 4. (A) Der schwarze Draht, der immer noch durch die Haarspange am Kontakt befestigt ist. (B,C) Mit einer zweiten Haarspange wird der rote Draht an Ort und Stelle gehalten. Beachten Sie, dass der rote Draht mit der Anode “A+” verlötet ist. (D) Zugabe einer großzügigen Menge Lötmittel zur Lötspitze. (E) Die Lötspitze drückt auf den Draht, schmilzt das Lot auf dem LED-Sockel und den Draht sowie die Lötpaste unter der LED. (F) Die heiße LED-Basiskühlung nach dem Löten. (G) Der LED-Sockel mit den verlöteten Drähten und der LED. (H,I) Rote Pfeile zeigen auf Lötpads. Nach dem Löten erscheint das Lot metallisch/glänzend (im Vergleich zu Grau vor dem Löten (ergänzende Abbildung 16D)). Ergänzende Abbildung 21: Anschließen des LED-Kabels an einen Kabel-an-Draht-Stecker. (A) Abisolierte Drähte und männlicher Draht-an-Draht-Stecker neben dem Schrumpfschlauch in zwei Hälften geschnitten (1/8 Zoll und 3/16 Zoll). (B) Schrumpfschlauch vor dem Löten über die Drähte legen. (C) Drähte, die vor dem Löten miteinander verdrillt werden. (D) Die gelötete Verbindung vom Draht zum Draht-an-Draht-Steckverbinder. (E) Sowohl der rote als auch der schwarze Draht sind miteinander verlötet. (F) Platzierung des 1/8-Zoll-Schrumpfschlauchs über der Lötverbindung. (G) Der Schrumpfschlauch nach dem Schrumpfen mit der Heißluftpistole. (H) Platzierung des 3/16-Zoll-Schrumpfschlauchs über dem kleineren Schrumpfschlauch. (I) Die Verbindung ist mit dem Schrumpfschlauch verlötet und abgedichtet. Ergänzende Abbildung 22: Befestigung der Drähte und LEDs am LED-Sockel mit Epoxidharz. (A) Verwenden Sie einen Holzapplikator, um Epoxidharz in den LED-Sockel zu legen. Darunter befindet sich ein Klebeband, um tropfendes Epoxidharz aufzufangen. (B) Epoxidharz wird gleichmäßig über die gesamte Oberfläche verteilt. (C) Die LED wird über Nacht ausgehärtet. Ergänzende Abbildung 23: Montage von LEDs in einem Deckel der Schachtel. (A) Eine LED mit einem Touch-Verschlussstück, das für eine einfache Montage angebracht ist. (B) Verschiedenfarbige LEDs, die mit einem Touch-Verschluss auf der Innenseite einer Blackbox montiert sind. (C) Eine Kerbe auf dem Deckel der Blackbox, die von einem Hochgeschwindigkeits-Rotationswerkzeug erzeugt wird, um Platz für den LED-Draht zu schaffen. (D) Eine Blackbox zur Stimulation der Zellen mit Touch-Verschlüssen zur Befestigung der LED. (E) Platzierung einer Multiwell-Schüssel in der Touch-Verschluss-Version der LED-Box. Ergänzende Abbildung 24: Anbringen von LEDs außerhalb eines Gehäusedeckels. (A) Loch in den Deckel des schwarzen Kastens gebohrt, mit einer Kerbe aus dem Hochgeschwindigkeits-Rotationswerkzeug, um Platz für den Draht zu schaffen (roter Pfeil). (B) LED in das Loch mit dem Draht in der Kerbe gesteckt und mit Klebeband an Ort und Stelle gehalten. (C) Zwei weitere Stücke Klebeband werden verwendet, um die LED zu befestigen. Die Rückseite des Kühlkörpers ist freigelegt, um den Wärmeaustausch zu maximieren. (D) Sichtschutzfolie, die über das Loch geklebt wird, in dem die LED platziert wird. Der rote Pfeil zeigt auf die Sichtschutzfolie. (E) Ein schwarzer Kasten zur Stimulation der Zellen mit einer außerhalb des Kastens angebrachten LED und mit Sichtschutzfolie zur Streuung der Beleuchtung. (F) Platzierung einer Multiwell-Schüssel in der externen LED + Sichtschutzfolie der LED-Box. Ergänzende Abbildung 25: Bohrungen von Löchern auf dem Kastendeckel für den Netzschalter und die Potentiometer. (A) Eine CAD-Zeichnung mit kommentierten Abmessungen des Deckels der Schachtel. (B) Der Deckel des Kastens mit den Löchern für das Potentiometer und den Netzschalter. Ergänzende Abbildung 26: Vorbereitung der Drahtauslassöffnung . (A) Eine CAD-Zeichnung mit kommentierten Abmessungen. (B) Bild des Bohrlochs mit dem Bohrer. (C) Glätten der Auslassöffnung mit Hochgeschwindigkeits-Rotationswerkzeug oder Feilwerkzeug. (D) Einsetzen der Tülle in die Auslassöffnung. Ergänzende Abbildung 27: Platzierung des Mikrocontrollers und der Leiterplatte in der Box. (A) Der Mikrocontroller-Halter (orange) und die Leiterplattenhalter im Inneren des Gehäuses. (B) Der Mikrocontroller und die Platine sind in der Box befestigt. Ergänzende Abbildung 28: Platzierung der Potentiometer und des Netzschalters. (A) Vorderansicht eines Deckels der Schachtel mit einem Netzschalter und vier Behältern. (B) Eine Vorderansicht des Deckels des Gehäuses mit zusätzlichen Potentiometerknöpfen. (C) Eine Rückansicht des Deckels des Kastens mit den angebrachten Teilen. Ergänzende Abbildung 29: Die montierte LED-Steuerung. (A) Eine offene Steuerbox, bei der die Drähte mit einem Etikettendrucker beschriftet und zur Organisation mit einem Reißverschluss verbunden sind. (B) Die Box, sobald sie vollständig montiert ist, wobei jeder Topf zusammen mit der PIN beschriftet ist. Ergänzende Abbildung 30: Platzierung des gecrimpten Draht-an-Draht-Steckverbinders. (A) Bild der gecrimpten Wire-to-Wire-Steckverbinder für ein System mit vier LED-Mikrocontrollern. (B) Platzierung des gecrimpten Steckers in den Mikrocontroller-Ports. Ergänzende Abbildung 31: Platzierung der Überbrückungsdrähte. (A) Eine Platine, auf der die Koordinaten der roten Überbrückungsdrähte beschriftet sind. (B) Eine Platine, auf der die Koordinaten der gelben Überbrückungsdrähte beschriftet sind. Ergänzende Abbildung 32: Platzierung der Überbrückungsdrähte. Eine Platine, die die Koordinaten der gelben Überbrückungsdrähte anzeigt. Ergänzende Abbildung 33: Hinzufügen der Spannungsregler. Die LM317T-Spannungsregler werden dem Stromkreis hinzugefügt, wobei ihre Koordinaten in den Diagrammen beschriftet sind. Ergänzende Abbildung 34: Einsetzen der 820Ω-Widerstände. Die R1-Widerstände werden der Schaltung hinzugefügt, wobei ihre Koordinaten in den Diagrammen beschriftet sind. Ergänzende Abbildung 35: Einsetzen der Transistoren. Die 2N2222A-Transistoren werden der Schaltung hinzugefügt, wobei ihre Koordinaten in den Diagrammen beschriftet sind. Ergänzende Abbildung 36: Einsetzen der Draht-an-Draht-Buchsen und Widerstände (optional) für die POT-Verbindung. Die Drähte und Widerstände werden der Schaltung hinzugefügt, wobei ihre Koordinaten in den Diagrammen beschriftet sind. (A) Stecken Sie den roten Draht ein, gefolgt vom R2-Widerstand (560 Ω) (nur für den Niederspannungsstromkreis). (B) Führen Sie das andere Ende des Widerstands in die angezeigte Erdungsbohrung ein. (C) Stecken Sie die schwarzen Drähte in die markierten Löcher, um sie mit der Masse zu verbinden. Hinweis: R2 (560 Ω) ist parallel zum Potentiometer. Ergänzende Abbildung 37: Einfügen von Draht-an-Draht-Steckern für den Mikrocontrolleranschluss und die Spannungsversorgung. Die Drähte werden der Schaltung hinzugefügt, wobei ihre Koordinaten in den Diagrammen beschriftet sind. (A) Führen Sie die roten Drähte in die angezeigten Löcher ein. (B) Führen Sie die schwarzen Drähte in die markierten Löcher ein. Ergänzende Abbildung 38: Hinzufügen von LED-Wire-to-Wire-Steckverbindern. (A) Kabel-an-Draht-Buchsen, bei denen die roten Leitungskoordinaten hervorgehoben sind. (B) Kabel-an-Draht-Buchse mit hervorgehobenen schwarzen Anschlusskoordinaten. Ergänzende Abbildung 39: Aufbau eines PhyB-PIF3-Genschalter-Experiments. (A) Eine Beispieltabelle eines Master-Mixes, der Renilla für die interne Kontrolle enthält. (B) Eine Beispieltabelle für den Aufbau der DNA-Mischung für einen Dual-Luciferase-Reporter-Assay eines optogenetischen PhyB-PIF3-Experiments. (C) Eine Beispieltabelle für das Einstellen des PEI-Transfektionsreagenzes und das Aliquotieren des Gemisches auf Zellen (tropfenweise). (D) Platzierung des Belichtungsmessers zum Einstellen der LED-Helligkeit.

Discussion

Das hier beschriebene LED-System wurde in unserem Labor verwendet, um verschiedene optogenetische Werkzeuge zu optimieren, zu charakterisieren und mit ihnen zu arbeiten. In Kyriakakis et ^al.4 haben wir viele Kombinationen von PhyB-PIF-Genschaltern parallel getestet. Wir haben dieses System dann verwendet, um Lichtimpulse mit verschiedenen Frequenzen zu testen, um die Genschalterkinetik und die effektive Lichtintensität zu messen. Dieses System wurde auch verwendet, um zwei optogenetische Systeme zu optimieren und zu charakterisieren, die blaues Licht für die Stimulation ^5,6 verwenden. Da nur eine LED hell genug sein muss, um die meisten optogenetischen Werkzeuge zu aktivieren, ist es nicht immer notwendig, ein System mit einer großen Anzahl von LEDs über jeder Vertiefung zu kaufen. Dieses Setup ist kostengünstig, zuverlässig, einfach zu rekonfigurieren und erfordert keine elektrischen Vorkenntnisse, um das Montageprotokoll zu befolgen.

In den ergänzenden Ergänzungsabbildungen 31–38 beschreiben wir, wie bis zu vier LEDs in das System integriert werden können. Während dies einige Experimente einschränken kann, die eine große Anzahl von parallelen Bedingungen erfordern, können mehr LEDs hinzugefügt werden, indem die in diesem Protokoll verwendete 9-Volt-Stromversorgung durch eine höhere Wattzahl ersetzt wird. Ebenso können mehrere LEDs mit geringerer Leistung parallel zu jedem Stromkreis angeschlossen werden. In dieser letzteren Anordnung werden einige LEDs nicht einzeln angesteuert, aber dies kann nützlich sein, wenn viele LEDs benötigt werden, um einen größeren Bereich abzudecken. Sobald Sie mit der Elektronik dieses Systems vertraut sind, gibt es viele Möglichkeiten, es anzupassen. Weitere Strategien zur Anpassung des Systems umfassen die Platzierung der LED weiter oder näher an der Probe und die Beleuchtung durch Filter/Diffusoren für homogene Beleuchtungsbedingungen oder zur Verhinderung von Erwärmung wie in (ergänzende Abbildung 23) und Allen et ^al.5. Ein weiteres bemerkenswertes Merkmal unseres LED-Designs ist, dass es in Epoxidharz gekapselt ist und einen Touch-Verschluss auf der Rückseite hat. Dadurch kann die LED praktisch überall sicher und einfach platziert werden: in Inkubatoren, Aquarien, Tierkäfigen, Wänden usw.

Viele Experimente, die Optogenetik verwenden, um Gene, Signalwege und andere zelluläre Aktivitäten zu kontrollieren, erfordern oft Pulse, erstrecken sich über große Zeitskalen oder müssen in einem Inkubator durchgeführt werden, was eine Automatisierung oder Fernmanipulation ohne Mikroskop erfordert. Dieses LED-System wurde über mehrere Monate kontinuierlich in einem befeuchteten CO₂ -Inkubator ohne Probleme getestet. Darüber hinaus muss der Experimentator bei reversiblen Systemen wie optogenetischen PhyB-Systemen möglicherweise spezifische pulsierende Beleuchtungspläne programmieren. In unserer vorherigen Arbeit⁴ haben wir pulsierende Programme verwendet, um die Reversibilitätsdynamik eines PhyB-PIF3-Schalters in Säugetierzellen über die Benutzeroberfläche zu testen. Mit der in diesem Manuskript beschriebenen Methodik ist die Programmierung eines Pulsprotokolls einfach und bietet die Flexibilität und Autonomie, die für viele Arten von optogenetischen Experimenten auf benutzerfreundliche Weise erforderlich sind.

Zu den wichtigsten Schritten beim Aufbau dieses Systems gehören das Zusammensetzen der elektrischen Schaltung auf der Leiterplatte und das Anschließen der Komponenten, die in Abschnitt 1 und Abschnitt 2 beschrieben sind. Es ist wichtig, jeden Schritt in diesen Abschnitten sorgfältig zu befolgen und die Lochnummern Zeile für Zeile zu überprüfen, bevor jede Komponente gelötet wird. In Abschnitt 2 wird erläutert, wie die Komponenten eingerichtet werden, die an den Stromkreis angeschlossen werden. Damit sich die Komponenten in der richtigen Ausrichtung verbinden, ist es besonders wichtig, darauf zu achten, dass die Farben der schwarzen und roten Drähte an den Wire-to-Wire-Steckverbindern übereinstimmen. Kleine Versäumnisse in diesen beiden Abschnitten werden sich sehr wahrscheinlich auf die Funktionalität des Systems auswirken. In der Tat besteht der erste Schritt bei der Fehlerbehebung dieser Methode darin, zu überprüfen, ob die Schaltung korrekt aufgebaut wurde und ob alle Verbindungen vorhanden sind. Zweitens ist die Überprüfung der Lötqualität auf lose Verbindungen und der Drähte auf aufplatzende Drahthaare, die den Stromkreis kurzschließen können, von besonderer Bedeutung. Ein dritter Schritt besteht darin, sicherzustellen, dass die LEDs korrekt funktionieren, was über ein Netzteil oder eine 1,5-V-Batterie erfolgen kann, indem die beiden Anschlüsse der LED mit Krokodilklemmen beschnitten werden. Eine weitere potenziell kritische Überlegung ist die Vermeidung von Erwärmung (wenn die LEDs mit hoher Leistung verwendet werden) oder die Streuung des Lichts für eine breitere Beleuchtung. Um diesen Überlegungen Rechnung zu tragen, können die LEDs außerhalb einer Blackbox mit “Sichtschutzfolie” auf der Innenseite montiert werden, wie in Ergänzende Abbildung 23 und Allen et ^al.5 beschrieben. Aufgrund der Einfachheit dieses Systems ist es nicht schwierig, es auseinanderzunehmen, um modulare Komponenten zu überprüfen, zu modifizieren, zu aktualisieren oder zu reparieren.

Ein weiterer kritischer Faktor für induzierbare Gensysteme ist die Überlegung, wie viel Aktivierung erforderlich ist oder wie viel Undichtigkeit für das zu kontrollierende biologische System akzeptabel ist. Wie in Abbildung 6 dargestellt, können diese mit der Menge an Reporter-DNA variieren. Darüber hinaus variiert die Transfektionseffizienz und damit die Kopienanzahl der Reporterkonstrukte in jeder Zelle. Es kann für einige Experimente vorteilhaft sein, eine Zelllinie mit einer festen Menge an Reporter- oder PhyB-Genschalterkomponenten herzustellen und nach Klonen mit dem gewünschten induzierten Expressionsbereich zu suchen, wie es üblicherweise bei medikamenteninduzierbaren Systemen der Fall ist. Aufgrund der Größe und Instabilität des lentiviralen Plasmids pPK-230⁴ haben wir auch nicht-lentivirale Plasmidversionen des PhyB-Schalters im pcDNA-Backbone pPK-351 (Addgene #157921) und pPK-352 (Addgene #157922) hergestellt.

Durch den Bau dieses LED-Beleuchtungssystems nach diesem Protokoll verfügen die Benutzer über alle notwendigen Komponenten, um eine Vielzahl von optogenetischen Experimenten in vitro und in vivo durchzuführen. In Kombination mit den Anweisungen für die Verwendung von PhyB-PIF3 in Säugetierzellen wird dieses Protokoll es Nicht-Ingenieuren und Biologen ermöglichen, die PhyB-basierte Optogenetik flexibel und effektiv in einer Vielzahl von Kontexten einzusetzen.

Materials

18AWG 2pin RED Black wire	Amazon	15M-28AWG-2468	Inexpensive wire to connect LEDs to the power circuit. https://www.amazon.com/gp/product/B072KGYH1M/ref=oh_aui_detailpage_o05_s00?ie=UTF8&psc=1
1K Ohm potentiometer	Amazon	52161500	2 x 1K Ohm potentiometer potential + 2 x black control Knob. https://www.amazon.com/gp/product/B00XIWA2GO/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1
20 Gauge Silicone JST Connector	Amazon	SIM&NAT 5.9 inch 2 Pin Male Female JST RCY Plug Connectors	These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/gp/product/B071XN7C43/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1
22 AWG solid jumper wires	Amazon	WJW-60B-R	Jameco Valuepro WJW-60B-R Wire Jumper Kit 350 each 22 AWG, 14 Lengths 10 Colors 25 Of Each Length. https://www.amazon.com/Jameco-Valuepro-WJW-60B-R-Jumper-Lengths/dp/B01KHWEB3W/ref=sr_1_5?s=industrial&ie=UTF8&qid=1519261370&sr=1-5&keywords=solid+wire+breadboard&dpID=51UopZhPJeL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch
560 ohm 1/2watt 1% tolerance	Amazon	a14051600ux0301	Uxcell a14051600ux0301 60 Piece Axial Lead 1% Tolerance Colored Ring Metal Film Resistor Resistance, 560 Ohm 1/2W. https://www.amazon.com/a14051600ux0301-Tolerance-Colored-Resistor-Resistance/dp/B016ZU2DGC/ref=pd_day0_328_9?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B016ZU2DGC&pd_rd_r=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN&pd_rd_w=txGNx&pd_rd_wg=ELyii&psc=1&refRID=XTM6KHQ3NT8DHWB1QWZN
820 ohm 1/2watt 1% tolerance	Amazon	TTL-A-8035-50Ea	Set of 50Ea Metal Film Resistor 820 Ohm 1% 1/2W (0.5W). https://www.amazon.com/50Ea-Metal-Film-Resistor-0-5W/dp/B00VGU2SS0/ref=sr_1_14?s=industrial&ie=UTF8&qid=1518045187&sr=1-14&keywords=1%2F2W+820+Ohm+resistor
A Male to B Male Cable (10 Feet)	Amazon	Part# 30-001-10B	The cable that comes with the Arduino doesn't fit well in the box. https://www.amazon.com/gp/product/B001MSU1HG/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1
Ardiuino UNO equivilent	Amazon	Elegoo EL-CB-001	UNO R3 Board ATmega328P ATMEGA16U2 with USB Cable for Arduino. https://www.amazon.com/gp/product/B01EWOE0UU/ref=oh_aui_detailpage_o03_s00?ie=UTF8&psc=1
Arduino holder	Digikey	X000018	Fits very snug. https://www.digikey.com/product-detail/en/arduino/X000018/1050-1150-ND/8135632
Black boxes for circuits and light chambers	Amazon	1591ESBK	Hammond 1591ESBK ABS Project Box Black. https://www.amazon.com/gp/product/B0002BSRIO/ref=oh_aui_detailpage_o07_s00?ie=UTF8&psc=1
Blue LED	Digikey	LXML-PB01-0040	LED LUXEON REBEL BLUE SMD. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/product-detail/en/lumileds/LXML-PB01-0040/1416-1029-1-ND/3961134
Cable ties	Amazon	sd027	Tarvol Nylon Zip Ties (Pack of 100) 8 Inch with Self Locking Cable Ties (White). https://www.amazon.com/Tarvol-Nylon-Locking-Cable-White/dp/B01MRD0JRR/ref=sr_1_7?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261882&sr=1-7&keywords=Cable+ties&dpID=51zUNmuUjyL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch
Command Fridge Clips	Amazon	17210CLR	Clips for holding circuit board inside of the black box. Command strips can also be used. https://www.amazon.com/gp/product/B0084M69YM/ref=oh_aui_detailpage_o00_s01?ie=UTF8&psc=1
Cyan LED	Digikey	LXML-PE01-0070	LED LUXEON REBEL CYAN SMD. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1031-1-nd
Electrical tape – 3M Scotch #35 Electrical Tape Value Pack	Amazon	03429NA	Scotch 700 Electrical Tape, 03429NA, 3/4 in x 66 ft. https://www.amazon.com/Scotch-Electrical-Tape-4-Inch-66-Foot/dp/B001ULCB1O/ref=psdc_256161011_t1_B001B19FDK
Farred LED 720nm	Luxeon Star LEDs	LXML-PF01	Far Red (720nm) LUXEON Rebel LED. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.luxeonstar.com/lxml-pf01-far-red-luxeon-rebel-led-260mW
Farred LED 740nm	Ushio	EDC740D-1100-S5	Uses "STAR XP 3535" base https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf
Farred LED 780nm	Ushio	EDC780D-1100	Uses "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf
Farred LED 810nm	Ushio	EDC810D-1100	Uses "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf
Farred LED 850nm	Ushio	EDC850D-1100	Uses "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf
Grommets	Amazon	Pico 6120D	These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Pico-6120D-Vinyl-Grommets-Package/dp/B0002ZG47G
Hair/Alligator Clips	Amazon		1-3/4 Inch (45 Mm)- Hair Clips Single Prong Metal Alligator Clips Hairbow Accessory -Silver,50 Pcs. https://www.amazon.com/gp/product/B00K09T3L8/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1
LED base	Luxeon Star LEDs	LXB-RS20A	Saber 20 mm Star Blank Aluminum MCPCB Base For Rebel LEDs https://www.luxeonstar.com/saber-20mm-star-blank-mcpcb-base-for-a-rebel-leds
LED PCB fopr Ushio LEDs	Adura LED solutions	STAR XP 3535 Package LED	Fits many other LEDs by Ushio http://aduraled.com/product/pcb/1901-star-xp-3535-package-led
Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe	Amazon	1943587	Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe. https://www.amazon.com/Loctite-Multi-Purpose-0-85-Fluid-Syringe-1943587/dp/B011INNBN0/ref=psdc_256243011_t4_B0044FBB8C
NTE Heat Shrink 2:1 Assorted Colors and Sizes 160 PCS	Amazon	B000FIDTYG	These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/NTE-Heat-Shrink-Assorted-Colors/dp/B000FIDTYG/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261282&sr=1-1&keywords=nte+shrink&dpID=41L5l7LCfiL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch
Picture Hanging Velcro Strips	Amazon	PH204-16NA	With these you can hang the LEDs in many places. https://www.amazon.com/Command-Picture-Hanging-16-Pairs-PH204-16ES/dp/B073XS3CHV/ref=pd_sim_60_5?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B073XS3CHV&pd_rd_r=112KGQJNRRYD0RAT598H&pd_rd_w=3n34Q&pd_rd_wg=sRvec&psc=1&refRID=112KGQJNRRYD0RAT598H
Power supply	Amazon	tb013	Any other 9V 1.5Z AC/DC converter will do becuase we cut the end off anyway. https://www.amazon.com/gp/product/B06Y1LF8T5/ref=oh_aui_detailpage_o07_s01?ie=UTF8&psc=1
Power switch Rocker Switch	Amazon	SIXQJZML	These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.ca/COOLOOdirect-Solder-Rocker-Switch-Toggle/dp/B071Y7SMVQ/ref=sr_1_31?_encoding=UTF8&c=ts&dchild=1&keywords=Boat+Rocker+Switches&qid=1594434474&s=sports&sr=1-31&ts_id=2438617011
Rectangular Connectors – for crimped wires	Digikey	2183-1905-ND	6 Rectangular Connectors – Housings Black 0.100" (2.54mm) https://www.digikey.com/product-detail/en/pololu-corporation/1905/2183-1905-ND/10450382?utm_adgroup=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=Shopping_Product_Connectors%2C%20Interconnects_NEW&utm_term=&utm_content=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&gclid=Cj0KCQjwvIT5BRCqARIsAAwwD-QmETT-ko07ote5VQgodKvWU0uDG8GYN7Vj-6WVBBOWdSgPaPd9azAaAhVLEALw_wcB
Red LED	Digikey	LXM3-PD01	LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1701-1-nd
Sandpaper	Amazon	B002NEV6GS	3M Wetordry Sandpaper, 03022, 800 Grit, 3 2/3 inch x 9 inch. https://www.amazon.com/3M-03022-Imperial-Wetordry-Sandpaper/dp/B002NEV6GS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=3M+Imperial+Wetordry+3-2%2F3+in.+x+9+in.+800+Grit+Sandpaper+Sheets+%2810+Sheets-Pack%29&qid=1594435012&sr=8-1
Solder for soldering wires and circuit components	Amazon	Mudder Lead Free Solder Wire Sn99 Ag0.3 Cu0.7 with Rosin Core for Electrical Soldering 0.22lbs (0.6 mm)	These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Mudder-Solder-Electrical-Soldering-0-22lbs/dp/B01B61TWGY
Solder-able Breadboard for building the circuit	Amazon	GK1007	Gikfun Solder-able Breadboard Gold Plated Finish Proto Board PCB Diy Kit for Arduino (Pack of 5PCS) GK1007. https://www.amazon.com/gp/product/B071R3BFNL/ref=oh_aui_detailpage_o04_s00?ie=UTF8&psc=1
Spade drill bit	Amazon	Irwin 88811	These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Speedbor%C2%AE-Blue-GrooveTM-Standard-Length-Woodboring/dp/B017S9JXB2/ref=sr_1_10?ie=UTF8&qid=1519516560&sr=8-10&keywords=11%2F16+spade+bit
Transistor	Newark	2N2222A	Can buy from many places. http://www.newark.com/nte-electronics/2n2222a/bipolar-transistor-npn-40v-to/dp/10M4197
Voltage regulator	Newark	LM317T	Equivilent to NTE956. https://www.newark.com/stmicroelectronics/lm317t/adjustable-linear-regulator-1/dp/89K0685?gclid=CjwKCAiAu9vwBRAEEiwAzvjq-1rmUi6lvOIFFt-BxttHXvmAeUoni4NM0BW-BtM_LMliSqxA9Xq4KxoCfikQAvD_BwE&mckv=sQqHZDDRz_dc|pcrid|219869297712|plid||kword|lm317t|match|p|slid||product||pgrid|35966450488|ptaid|kwd-541160713|&s_kwcid=AL!8472!3!219869297712!p!!g!!lm317t&CMP=KNC-GUSA-SKU-MDC
Windows 10 tablet	Amazon	B08BYTT79Y	Any Windows 10 PC will do. https://www.amazon.com/gp/product/B08BYTT79Y/ref=ppx_yo_dt_b_asin_title_o01_s00?ie=UTF8&psc=1
Cell Culture Reagents
Human Embryonic Kidney 293 cells HEK293	ATCC	ATCC CRL-1573	Common Cell line. https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	26140079	These are very common and there are many equivalents. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079
Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose	ThermoFisher	11965−092	These are very common and there are many equivalents. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118
10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin	ThermoFisher	15140122	These are very common and there are many equivalents. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122
White Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates	ThermoFisher	07-200-589	White plates are preferred. Do not use clear plates. https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates-8/p-152852
PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	PolySciences	24765-1	Can be replaced with another transfection reagent. https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/
Name of Equipment
Diagonal Cutting Plier (110mm)	Amazon	Proskit 1PK-037S	These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&keywords=diagonal+cutting+pliers&qid=1594436230&sr=8-11
Dremil 3000 with cutting tool and grinder	Amazon	Dremel 3000	Dremel 3000-2/28 Variable Speed Rotary Tool Kit- 1 Attachments & 28 Accessories- Grinder, Sander, Polisher, Router, and Engraver. https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&qid=1594436404&s=hi&sr=1-3
Dremil cutting and grinding tool	Amazon	Dremel 200-1/15	Any similar Dremil will work. https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268058&sr=1-1&keywords=dremel+200&dpID=41h9ZucnTYL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch
Dremil grinding tip	Amazon	Dremel 84922	Silicon Carbide Grinding Stone. https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268585&sr=1-1-fkmr0&keywords=dremel+tip+84922
EDSYN The Original Deluxe SOLDAPULLT	Amazon	DS017	For removing solder/mistakes. https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI
Helping Hand with Magnifying Glass	Amazon	SE MZ101B	These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268108&sr=1-4&keywords=Helping+hands&dpID=31GEhMw7WvL&preST=_SX300_QL70_&dpSrc=srch
Pointed Nose Micro Pliers	Amazon	Hakko CHP PN-20-M	Steel Super Specialty Pointed Nose Micro Pliers with Smooth Jaws, 1.0mm Nose. https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268153&sr=1-1&keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&dpID=3109XRgwn3L&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch
Small screw drivers	Amazon	Wiha 26197	These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/26197-Precision-Slotted-Phillips-Screwdrivers/dp/B01L46TEN2/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268018&sr=1-1&keywords=Wiha+precision+set
Soldering iron	Amazon	Yihua 939D+ Digital Soldering Station	These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Professional-Digital-Soldering-Station-Switch/dp/B07YSCBZ4F/ref=psdc_13837391_t1_B07RVMZNYR
TraceTech No-Clean Flux Pen	Amazon	2507-N	Tech Spray 2507-N No-Clean Flux Dispensing Pen, 11.5 mL. https://www.amazon.com/Tech-Spray-2507-N-No-Clean-Dispensing/dp/B00DDF2FYS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=2507-N&qid=1595469618&sr=8-1
Weller WSA350 120v Bench Top Smoke Absorber	Amazon	WSA350	For soldering safety. https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK
Wire strippers	Amazon	CSP-30-7	These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7-Stripper-Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG
IWISS IWS-3220M Micro Connector Pin Crimping Tool 0.03-0.52mm² 32-20AWG	Amazon	IWS-3220M	These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/gp/product/B078WPT5M1/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1