यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि PhyB और PIF3 का उपयोग करके लाल और दूर-लाल प्रकाश के साथ जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक प्रयोग कैसे करें। एक सरल और लचीली रोशनी प्रणाली के निर्माण के लिए चरण-दर-चरण निर्देश शामिल हैं, जो कंप्यूटर के साथ जीन अभिव्यक्ति या अन्य ऑप्टोजेनेटिक्स के नियंत्रण को सक्षम बनाता है।
प्रकाश का उपयोग करके जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने से सटीकता और गति में वृद्धि हुई है जिसके साथ शोधकर्ता कई जैविक प्रक्रियाओं में हेरफेर कर सकते हैं। ऑप्टिकल नियंत्रण कार्य को विच्छेदित करने की अभूतपूर्व क्षमता की अनुमति देता है और नवीन आनुवंशिक उपचारों को सक्षम करने की क्षमता रखता है। हालांकि, ऑप्टोजेनेटिक प्रयोगों को स्थानिक, अस्थायी या तीव्रता नियंत्रण के साथ पर्याप्त प्रकाश स्रोतों की आवश्यकता होती है, जो अक्सर शोधकर्ताओं के लिए एक अड़चन होती है। यहां हम विस्तार से बताते हैं कि कम लागत और बहुमुखी एलईडी रोशनी प्रणाली कैसे बनाई जाए जो विभिन्न उपलब्ध ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों के लिए आसानी से अनुकूलन योग्य है। यह प्रणाली समायोज्य एलईडी तीव्रता के साथ मैन्युअल या कंप्यूटर नियंत्रण के लिए कॉन्फ़िगर करने योग्य है। हम सर्किट के निर्माण, इसे कंप्यूटर-नियंत्रित बनाने और एलईडी के निर्माण के लिए एक सचित्र चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका प्रदान करते हैं। इस उपकरण की असेंबली को सुविधाजनक बनाने के लिए, हम कुछ बुनियादी सोल्डरिंग तकनीकों पर भी चर्चा करते हैं और एलईडी को नियंत्रित करने के लिए उपयोग की जाने वाली सर्किटरी की व्याख्या करते हैं। हमारे ओपन-सोर्स यूजर इंटरफेस का उपयोग करके, उपयोगकर्ता व्यक्तिगत कंप्यूटर (पीसी) या एक सस्ती टैबलेट पर प्रकाश के सटीक समय और स्पंदन को स्वचालित कर सकते हैं। यह स्वचालन सिस्टम को उन प्रयोगों के लिए उपयोगी बनाता है जो जीन, सिग्नलिंग मार्गों और अन्य सेलुलर गतिविधियों को नियंत्रित करने के लिए एलईडी का उपयोग करते हैं जो बड़े समय के पैमाने पर फैले होते हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए, आवश्यक सभी भागों का निर्माण करने या ऑप्टोजेनेटिक प्रयोगों को करने के लिए रोशनी प्रणाली का उपयोग करने के लिए इलेक्ट्रॉनिक्स में कोई पूर्व विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं है।
ऑप्टोजेनेटिक उपकरण सर्वव्यापी होते जा रहे हैं और जीन अभिव्यक्ति, सेल सिग्नलिंग और कई और 1,2,3 जैसे जैविक प्रक्रियाओं को ऑप्टिकल रूप से नियंत्रित करने के लिए नई तकनीक लगातार विकसित की जा रही है। प्रकाश के साथ सेलुलर प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने की क्षमता तेजी से कैनेटीक्स, तंग स्थानिक नियंत्रण और खुराक-निर्भर विनियमन की अनुमति देती है जिसे प्रकाश तीव्रता और एक्सपोजर समय द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। इन उपकरणों का उपयोग करने के लिए, इन मापदंडों को नियंत्रित करने के लिए एक उपकरण आवश्यक है। हमने हाल ही में एक आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड PhyB-PIF3 स्तनधारी जीन स्विच विकसित किया है जो क्रमशः लाल / दूर-लाल प्रकाश का उपयोग करके जीन को सक्रिय और निष्क्रिय करताहै। इस प्रणाली का परीक्षण कई स्तनधारी सेल लाइनों में किया गया था और प्रकाश की दालों सहित प्रकाश की बहुत कम मात्रा के साथ भी जीन अभिव्यक्ति के अद्वितीय प्रेरण को सक्षम किया गया था। PhyB स्विच और इसी तरह के उपकरण 5,6 का उपयोग करने के इच्छुक शोधकर्ता अक्सर रोशनी की तीव्रता और अवधि को नियंत्रित करने के तरीकों पर जानकारी का अनुरोध करते हैं। इसलिए, हमने ऑप्टोजेनेटिक्स के लिए इन उपकरणों को व्यापक रूप से अपनाने में सक्षम करने के लिए चरण-दर-चरण निर्देशों के साथ इस प्रोटोकॉल को विकसित किया।
एलईडी के व्यापक उपयोग से पहले, फिल्टर के साथ ब्रॉडबैंड प्रकाश स्रोतों का उपयोग फाइटोक्रोम 7 जैसे प्रकाश-उत्तरदायी प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए कियागया था। हाल ही में, कुछ एलईडी रोशनी प्रणालियों को ऑप्टोजेनेटिक टूल्स 8,9,10,11,12 के साथ प्रकाशित किया गया है, लेकिन उन प्रोटोकॉल को इलेक्ट्रॉनिक्स / सॉफ्टवेयर में महत्वपूर्ण विशेषज्ञता की आवश्यकता हो सकती है, विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है (जैसे, 3 डी प्रिंटर, लेजर कटिंग मशीन, या फोटोमास्क), या चरण-दर-चरण निर्देश प्रदान नहीं करते हैं जिन्हें कुछ शोधकर्ताओं को अपनी शोध आवश्यकताओं के लिए तैनात करने की आवश्यकता होगी। जबकि एक मल्टीवेल प्लेट में व्यक्तिगत कुओं का स्वतंत्र नियंत्रण उपयोगी हो सकता है, यह अक्सर अनावश्यक होता है जब शोधकर्ताओं को केवल प्रकाश और अंधेरे या लाल प्रकाश बनाम दूर-लाल प्रकाश में कई अलग-अलग नमूनों की तुलना करने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, सीमित अनुकूलन क्षमता के साथ कई मौजूदा वाणिज्यिक प्रणालियां महंगी हैं। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में वर्णित एलईडी लागत प्रभावी, उज्ज्वल हैं, और कई तरीकों से लगाए जा सकते हैं; इसलिए, उनका उपयोग कई अलग-अलग प्रकार के नमूनों को रोशन करने के लिए किया जा सकता है। प्रोटोकॉल और प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर के साथ, पराबैंगनी (यूवी) से लेकर एनआईआर तक के एलईडी का उपयोग यूवीआर 813,14, ड्रोंपा 15,16, एलओवी डोमेन 17,18, स्टेप फंक्शन ऑप्सिन 19,20, क्राई 21,22, फाइब 4,23,24 का उपयोग करके ऑप्टोजेनेटिक प्रयोगों को करने के लिए सॉफ्टवेयर के साथ नियंत्रित किया जा सकता है। , 25, बैक्टीरियल फाइटोक्रोम 26,27,28,29 और अन्य प्रकाश-उत्तरदायी प्रणाली 30,31,32।
यह प्रोटोकॉल प्रकाश उत्तेजना के लिए विभिन्न मापदंडों के साथ-साथ एक ऑप्टोजेनेटिक प्रयोग चलाने के लिए आणविक / सेलुलर उपकरणों को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक सर्किट और अन्य हार्डवेयर की असेंबली के लिए एक ट्यूटोरियल का गठन करता है। इसके अलावा, हम किरियाकाकिस एट अल.4 से अनुकूलित प्लास्मिड की रिपोर्ट करते हैं जो क्लोनिंग के लिए छोटे और अधिक स्थिर हैं। इस प्रोटोकॉल के माध्यम से, इलेक्ट्रॉनिक्स और प्रकाशिकी में विशेषज्ञता के बिना जीवविज्ञानी रोशनी प्रणालियों का निर्माण कर सकते हैं जो लचीले और मजबूत हैं। चरण-दर-चरण फैशन में, हम दिखाते हैं कि ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों को व्यापक रूप से अपनाने के लिए तकनीकी बाधा को दूर करते हुए एलईडी सिस्टम का निर्माण कैसे किया जाए। इस प्रणाली का उपयोग आसानी से अधिकांश सेल कल्चर इनक्यूबेटरों में किया जा सकता है, भले ही उनमें तार पोर्ट न हों। उदाहरण के लिए, हमने एलईडी सिस्टम को 6 महीने से अधिक समय तक लगातार ह्यूमिडिफायर सीओ2 इनक्यूबेटर में रखा है, जिसमें प्रदर्शन में कोई कमी नहीं आई है। हम यह भी बताते हैं कि एलईडी सिस्टम को कंप्यूटर से कैसे कनेक्ट किया जाए और इसे ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर के साथ इंटरफ़ेस किया जाए जो हम GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces) पर प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके एक प्रणाली का निर्माण शोधकर्ताओं को संभावित मुद्दों को डीबग करने, भागों को बदलने और कार्यक्षमताओं में सुधार / विस्तार करने के लिए बुनियादी ज्ञान प्रदान करता है।
सिस्टम अवलोकन
रोशनी प्रणाली के निर्माण में (1) इलेक्ट्रॉनिक सर्किट का निर्माण, (2) बाह्य उपकरणों (बिजली आपूर्ति कॉर्ड, पावर स्विच, आदि) का निर्माण, (3) एलईडी का निर्माण, (4) इन सभी घटकों को इकट्ठा करना, और (5) उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस के साथ एलईडी को नियंत्रित करने के लिए सॉफ्टवेयर स्थापित करना शामिल है (चित्रा 1 ए)। एक बार पूरा होने के बाद, रोशनी प्रणाली एक उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस (चित्रा 1 बी) के साथ स्वतंत्र रूप से चार एलईडी को नियंत्रित कर सकती है। उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस प्रत्येक एलईडी को निर्दिष्ट समय अंतराल पर पल्स करने और निर्दिष्ट समय के बाद बंद करने में सक्षम बनाता है। एक निर्दिष्ट समय पर रोशनी कार्यक्रम शुरू करने के लिए एक स्टार्ट-देरी भी है। पोटेंशियोमीटर (पीओटी) प्रत्येक एलईडी की तीव्रता को स्वतंत्र रूप से नियंत्रित करते हैं या कंप्यूटर के बिना मैन्युअल एलईडी नियंत्रण के लिए उपयोग किया जा सकता है। एलईडी के तार किसी भी कस्टम लंबाई हो सकते हैं, जिससे उन्हें आसानी से इनक्यूबेटर या लैब स्पेस में रखा जा सकता है। इन एलईडी की उच्च शक्ति के कारण, उनका उपयोग दूर से एकल एलईडी के साथ एक बड़े क्षेत्र को रोशन करने के लिए किया जा सकता है।
एलईडी ड्राइवर विवरण
एलईडी की तीव्रता को शक्ति और नियंत्रित करने के लिए, यह प्रोटोकॉल “एलईडी ड्राइवर” बनाने के चरणों से गुजरेगा। प्रत्येक एलईडी में वोल्टेज की एक श्रृंखला होती है जिसमें यह संचालित होता है (चित्रा 1 सी)। ऑपरेशन के दौरान, नियामक का आउटपुट वोल्टेज, जो प्रकाश तीव्रता को नियंत्रित करता है, को पोटेंशियोमीटर द्वारा ट्यून किया जा सकता है। पीओटी प्रतिरोध को बदलता है, आउटपुट वोल्टेज / चमक को समायोजित करता है। 1kH (1 किलो-ओम) POT के साथ ट्यूनिंग वह देती है जिसे हम “उच्च वोल्टेज सर्किट” कहते हैं और इसकी सीमा 1.35 V से 2.9 V होती है। चूंकि 2.9 V कम वोल्टेज LED (चित्रा 1C) के संचालन के लिए बहुत अधिक है, इसलिए हम एक एकल संशोधन (प्रतिरोधक 3 या “R3” पूरक चित्र 1A) दिखाते हैं जो कम वोल्टेज LED से मेल खाने की सीमा को सीमित करता है। आर 3 पोटेंशियोमीटर के समानांतर एलईडी पर लागू अधिकतम वोल्टेज को 1.85 वी ( पूरक चित्र 8 में विस्तृत असेंबली) तक कम करने का कार्य करता है। करंट के बजाय चमक को नियंत्रित करने के लिए वोल्टेज का उपयोग करके, सिस्टम विभिन्न ऑपरेटिंग वोल्टेज वाले एलईडी के लिए अधिक लचीला है। चित्रा 1 सी में इष्टतम सर्किट चयन का मार्गदर्शन करने के लिए उच्च और निम्न वोल्टेज एलईडी की एक सूची है। यह डिज़ाइन न्यूनतम वोल्टेज को काफी कम रखता है ताकि पोटेंशियोमीटर बंद होने पर एलईडी पूरी तरह से बंद हो जाए और वोल्टेज को एलईडी के विशिष्ट ऑपरेटिंग वोल्टेज से ऊपर जाने की अनुमति न दे। PhyB ऑप्टोजेनेटिक्स के लिए, हम गहरे लाल और दूर-लाल एलईडी का उपयोग करते हैं, जो कम वोल्टेज सर्किट का उपयोग करते हैं।
एलईडी कंप्यूटर नियंत्रण प्रणाली विवरण
एलईडी रोशनी प्रणाली का उपयोग कंप्यूटर या माइक्रोकंट्रोलर के बिना निरंतर रोशनी के लिए किया जा सकता है। हालांकि, स्पंदन कार्यक्रमों के लिए और व्यक्तिगत एलईडी समय को नियंत्रित करने के लिए, एक माइक्रोकंट्रोलर स्थापित किया जाना चाहिए। एलईडी को नियंत्रित करने के लिए माइक्रोकंट्रोलर का उपयोग करने के लिए, माइक्रोकंट्रोलर को सर्किट से जोड़ने के लिए एक ट्रांजिस्टर की आवश्यकता होती है। यह ट्रांजिस्टर माइक्रोकंट्रोलर से वोल्टेज को महसूस करता है और प्रवाहकीय या इन्सुलेट होने से स्विच करता है। “ऑन” और “ऑफ” को नियंत्रित करने के लिए, हम आर 2 (पूरक चित्रा 1 ए) में एक नियंत्रणीय शंट के रूप में “एनपीएन स्विचिंग टाइप ट्रांजिस्टर” (2 एन 2222) नामक का उपयोग करते हैं। जब माइक्रोकंट्रोलर से वोल्टेज ट्रांजिस्टर बेस पर लागू होता है, तो ट्रांजिस्टर प्रवाहकीय हो जाता है और एलईडी को बंद कर देता है, एलईडी वोल्टेज को कम कर देता है। इस प्रकार, एलईडी और ट्रांजिस्टर ऑन और ऑफ स्टेट्स को सीधे माइक्रोकंट्रोलर द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जिसे पीसी पर स्थापित सॉफ़्टवेयर द्वारा नियंत्रित किया जाता है।
रोशनी प्रणाली बनाने के लिए, निम्नलिखित चरणों की आवश्यकता होती है: विद्युत सर्किट का निर्माण; बिजली की आपूर्ति, मैनुअल पावर स्विच, पीओपीटी और माइक्रोकंट्रोलर कनेक्शन का निर्माण; एलईडी का निर्माण; रोशनी प्रणाली को फिट करने के लिए एक ब्लैक बॉक्स को समायोजित करें; सभी तारों और उपकरणों को कनेक्ट करें; एलईडी नियंत्रण सॉफ्टवेयर स्थापित करें, प्रकाश के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करें; दोहरी ल्यूसिफेरस परख का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति को मापें।
यहां वर्णित एलईडी प्रणाली का उपयोग हमारी प्रयोगशाला में कई ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों के साथ अनुकूलन, विशेषता और काम करने के लिए किया गया है। किरियाकाकिस एट अल.4 में, हमने समानांतर में फीबी-पीआईएफ जीन स्विच के कई संयोजनों का परीक्षण किया। फिर हमने जीन स्विच कैनेटीक्स और प्रभावी प्रकाश तीव्रता को मापने के लिए विभिन्न आवृत्तियों पर प्रकाश की दालों का परीक्षण करने के लिए इस प्रणाली का उपयोग किया। इस प्रणाली का उपयोग दो ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम को अनुकूलित करने और चिह्नित करने के लिए भी किया गया था जो उत्तेजना 5,6 के लिए नीली रोशनी का उपयोग करते हैं। चूंकि अधिकांश ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों को सक्रिय करने के लिए केवल एक एलईडी को पर्याप्त उज्ज्वल होने की आवश्यकता होती है, इसलिए प्रत्येक कुएं पर बड़ी संख्या में एलईडी के साथ एक प्रणाली खरीदना हमेशा आवश्यक नहीं होता है। यह सेटअप सस्ती, विश्वसनीय, पुन: कॉन्फ़िगर करने में आसान है, और असेंबली प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए कोई पूर्व विद्युत विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं है।
पूरक पूरक आंकड़े 31-38 में, हम वर्णन करते हैं कि सिस्टम में चार एलईडी को कैसे शामिल किया जाए। हालांकि यह बड़ी संख्या में समानांतर स्थितियों की आवश्यकता वाले कुछ प्रयोगों को सीमित कर सकता है, इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली 9 वोल्ट बिजली की आपूर्ति को उच्च वाट क्षमता के साथ बदलकर अधिक एलईडी जोड़े जा सकते हैं। इसी तरह, कई कम शक्ति वाले एलईडी को प्रत्येक सर्किट के समानांतर जोड़ा जा सकता है। इस बाद की व्यवस्था में, कुछ एलईडी को व्यक्तिगत रूप से नियंत्रित नहीं किया जाएगा, लेकिन यह तब उपयोगी हो सकता है जब एक बड़े क्षेत्र को कवर करने के लिए कई एलईडी की आवश्यकता होती है। एक बार इस प्रणाली के इलेक्ट्रॉनिक्स से परिचित होने के बाद, इसे अनुकूलित करने के कई तरीके हैं। सिस्टम को अनुकूलित करने के लिए अतिरिक्त रणनीतियों में एलईडी को नमूने के दूर या करीब रखना और समरूप रोशनी की स्थिति के लिए फिल्टर / डिफ्यूज़र के माध्यम से रोशन करना या हीटिंग को रोकना शामिल है (पूरक चित्र 23) और एलन एट अल.5। हमारे एलईडी डिजाइन की एक और उल्लेखनीय विशेषता यह है कि यह एपॉक्सी में समझाया गया है और इसमें पीठ पर एक टच फास्टनर है; यह एलईडी को लगभग कहीं भी आसानी से सुरक्षित रूप से रखा जा सकता है: इनक्यूबेटर, मछली के टैंक, पशु पिंजरों, दीवारों आदि में।
जीन, सिग्नलिंग मार्गों और अन्य सेलुलर गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग करने वाले कई प्रयोगों को अक्सर स्पंदन की आवश्यकता होती है, बड़े समय के पैमाने पर विस्तार ति किया जाता है, या इनक्यूबेटर में प्रदर्शन करने की आवश्यकता होती है, इसलिए माइक्रोस्कोप के बिना स्वचालितकरण या रिमोट मैनिपुलेशन की आवश्यकता होती है। इस एलईडी प्रणाली को बिना किसी समस्या के ह्यूमिडिफायर सीओ2 इनक्यूबेटर के अंदर कई महीनों तक लगातार परीक्षण किया गया है। इसके अतिरिक्त, PhyB ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम जैसे प्रतिवर्ती प्रणालियों के साथ, प्रयोगकर्ता को प्रोग्राम-विशिष्ट स्पंदन रोशनी शेड्यूल की आवश्यकता हो सकती है। हमारे पिछले काम4 में, हमने उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस के माध्यम से स्तनधारी कोशिकाओं में PhyB-PIF3 स्विच की रिवर्सबिलिटी गतिशीलता का परीक्षण करने के लिए स्पंदन कार्यक्रमों का उपयोग किया। इस पांडुलिपि में वर्णित पद्धति का उपयोग करते हुए, एक स्पंदन प्रोटोकॉल प्रोग्रामिंग आसान है, जो उपयोगकर्ता के अनुकूल तरीके से कई प्रकार के ऑप्टोजेनेटिक प्रयोगों के लिए आवश्यक लचीलापन और स्वायत्तता प्रदान करता है।
इस प्रणाली के निर्माण में सबसे महत्वपूर्ण कदमों में पीसीबी बोर्ड पर विद्युत सर्किट को एक साथ रखना और घटकों को जोड़ना शामिल है, जो खंड 1 और खंड 2 में विस्तृत हैं। इन अनुभागों में प्रत्येक चरण का सावधानीपूर्वक पालन करना और प्रत्येक घटक को सोल्डर करने से पहले पिनहोल संख्याओं को लाइन-दर-लाइन दोबारा जांचना आवश्यक है। खंड 2 बताता है कि सर्किट से जुड़े घटकों को कैसे सेट किया जाए। ताकि घटक सही अभिविन्यास में जुड़ते हैं, यह सुनिश्चित करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है कि तार-से-तार कनेक्टर पर काले और लाल तारों के रंग मेल खाते हैं। इन दो खंडों में छोटी निगरानी सिस्टम की कार्यक्षमता को प्रभावित करेगी। दरअसल, इस विधि के समस्या निवारण में पहला कदम यह जांचना होगा कि सर्किट सही ढंग से बनाया गया था और सभी कनेक्शन जगह में हैं। दूसरे, ढीले कनेक्शन के लिए सोल्डरिंग गुणवत्ता और तारों को फैलाने के लिए तारों की जांच करना जो सर्किट को शॉर्ट कर सकते हैं, विशेष महत्व का है। एक तीसरा कदम यह सुनिश्चित करना होगा कि एलईडी सही ढंग से काम कर रहे हैं, जिसे एलिगेटर क्लिप के साथ एलईडी के दो टर्मिनलों को क्लिप करके बिजली की आपूर्ति या 1.5 वी बैटरी का उपयोग करके किया जा सकता है। एक और संभावित महत्वपूर्ण विचार हीटिंग को रोकना है (उच्च शक्ति पर एलईडी का उपयोग करते समय) या व्यापक प्रसार रोशनी के लिए प्रकाश को अलग करना। इन विचारों को संबोधित करने के लिए, एलईडी को अंदर की ओर “गोपनीयता फिल्म” के साथ एक ब्लैक बॉक्स के बाहर रखा जा सकता है, जैसा कि पूरक चित्र 23 और एलन एट अल.5 में वर्णित है। इस प्रणाली की सादगी के कारण, मॉड्यूलर घटकों को सत्यापित करने, संशोधित करने, अपग्रेड करने या मरम्मत करने के लिए इसे अलग करना मुश्किल नहीं है।
इंड्यूसेबल जीन सिस्टम के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक यह विचार करना है कि जैविक प्रणाली को नियंत्रित करने के लिए कितनी सक्रियता की आवश्यकता है या कितना रिसाव स्वीकार्य है। जैसा कि चित्रा 6 में दिखाया गया है, ये रिपोर्टर डीएनए की मात्रा के साथ भिन्न हो सकते हैं। इसके अलावा, अभिकर्मक दक्षता और इसलिए, प्रत्येक सेल में रिपोर्टर संरचनाओं की प्रतिलिपि संख्या अलग-अलग होगी। कुछ प्रयोगों के लिए रिपोर्टर या फाइब जीन-स्विच घटकों की एक निश्चित मात्रा के साथ एक सेल लाइन बनाना फायदेमंद हो सकता है और प्रेरित अभिव्यक्ति की वांछित सीमा के साथ क्लोन के लिए स्क्रीन हो सकती है, जैसा कि आमतौर पर दवा इंड्यूसेबल सिस्टम के साथ किया जाता है। लेंटिवायरल प्लास्मिड पीपीके -2304 के आकार और अस्थिरता के कारण, हमने पीसीडीएनए बैकबोन पीपीके -351 (एडजीन # 157921) और पीपीके -352 (एडजीन # 157922) में फाइब स्विच के गैर-लेंटिवायरल प्लास्मिड संस्करण भी बनाए।
इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए इस एलईडी रोशनी प्रणाली का निर्माण करके, उपयोगकर्ताओं के पास विट्रो और विवो में ऑप्टोजेनेटिक्स प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला करने के लिए आवश्यक सभी घटक हैं। स्तनधारी कोशिकाओं में PhyB-PIF3 का उपयोग करने के निर्देशों के साथ संयुक्त, यह प्रोटोकॉल गैर-इंजीनियरों और जीवविज्ञानियों को लचीले और प्रभावी ढंग से, विभिन्न संदर्भों में PhyB-आधारित ऑप्टोजेनेटिक्स का उपयोग करने की अनुमति देगा।
The authors have nothing to disclose.
हम एलईडी सिस्टम के विभिन्न संस्करणों का परीक्षण करने के लिए यिंगशियाओ (पीटर) वांग, जिलियांग हुआंग और मौली एलन को धन्यवाद देना चाहते हैं क्योंकि इसे विकसित किया जा रहा था। इस काम को यूसी सैन डिएगो में कावली इंस्टीट्यूट फॉर ब्रेन एंड माइंड और साल्क इंस्टीट्यूट, नेशनल साइंस फाउंडेशन द्वारा ग्रांट सीसीएफ -0939370, एनआईएच ग्रांट एनएस 060847 और एनआईएच ग्रांट आर 21 डीसी018237 के तहत एनएसएफ सेंटर फॉर साइंस ऑफ इंफॉर्मेशन के माध्यम से समर्थित किया गया था।
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Farred LED 720nm | Luxeon Star LEDs | LXML-PF01 | Far Red (720nm) LUXEON Rebel LED. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.luxeonstar.com/lxml-pf01-far-red-luxeon-rebel-led-260mW |
Farred LED 740nm | Ushio | EDC740D-1100-S5 | Uses "STAR XP 3535" base https://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC740D-1100-S5.pdf |
Farred LED 780nm | Ushio | EDC780D-1100 | Uses "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC780D-1100.pdf |
Farred LED 810nm | Ushio | EDC810D-1100 | Uses "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC810D-1100.pdf |
Farred LED 850nm | Ushio | EDC850D-1100 | Uses "STAR XP 3535" base http://www.ushio-optosemi.com/jp/products/led/power/pdfs/edc/EDC850D-1100.pdf |
Grommets | Amazon | Pico 6120D | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Pico-6120D-Vinyl-Grommets-Package/dp/B0002ZG47G |
Hair/Alligator Clips | Amazon | 1-3/4 Inch (45 Mm)- Hair Clips Single Prong Metal Alligator Clips Hairbow Accessory -Silver,50 Pcs. https://www.amazon.com/gp/product/B00K09T3L8/ref=oh_aui_detailpage_o00_s00?ie=UTF8&psc=1 |
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LED base | Luxeon Star LEDs | LXB-RS20A | Saber 20 mm Star Blank Aluminum MCPCB Base For Rebel LEDs https://www.luxeonstar.com/saber-20mm-star-blank-mcpcb-base-for-a-rebel-leds |
LED PCB fopr Ushio LEDs | Adura LED solutions | STAR XP 3535 Package LED | Fits many other LEDs by Ushio http://aduraled.com/product/pcb/1901-star-xp-3535-package-led |
Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe | Amazon | 1943587 | Loctite Epoxy Clear Multi-Purpose, 0.85-Fluid Ounce Syringe. https://www.amazon.com/Loctite-Multi-Purpose-0-85-Fluid-Syringe-1943587/dp/B011INNBN0/ref=psdc_256243011_t4_B0044FBB8C |
NTE Heat Shrink 2:1 Assorted Colors and Sizes 160 PCS | Amazon | B000FIDTYG | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/NTE-Heat-Shrink-Assorted-Colors/dp/B000FIDTYG/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519261282&sr=1-1&keywords=nte+shrink&dpID=41L5l7LCfiL&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch |
Picture Hanging Velcro Strips | Amazon | PH204-16NA | With these you can hang the LEDs in many places. https://www.amazon.com/Command-Picture-Hanging-16-Pairs-PH204-16ES/dp/B073XS3CHV/ref=pd_sim_60_5?_encoding=UTF8&pd_rd_i=B073XS3CHV&pd_rd_r=112KGQJNRRYD0RAT598H&pd_rd_w=3n34Q&pd_rd_wg=sRvec&psc=1&refRID=112KGQJNRRYD0RAT598H |
Power supply | Amazon | tb013 | Any other 9V 1.5Z AC/DC converter will do becuase we cut the end off anyway. https://www.amazon.com/gp/product/B06Y1LF8T5/ref=oh_aui_detailpage_o07_s01?ie=UTF8&psc=1 |
Power switch Rocker Switch | Amazon | SIXQJZML | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.ca/COOLOOdirect-Solder-Rocker-Switch-Toggle/dp/B071Y7SMVQ/ref=sr_1_31?_encoding=UTF8&c=ts&dchild=1&keywords=Boat+Rocker+Switches&qid=1594434474&s=sports&sr=1-31&ts_id=2438617011 |
Rectangular Connectors – for crimped wires | Digikey | 2183-1905-ND | 6 Rectangular Connectors – Housings Black 0.100" (2.54mm) https://www.digikey.com/product-detail/en/pololu-corporation/1905/2183-1905-ND/10450382?utm_adgroup=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&utm_source=google&utm_medium=cpc&utm_campaign=Shopping_Product_Connectors%2C%20Interconnects_NEW&utm_term=&utm_content=Rectangular%20Connectors%20-%20Housings&gclid=Cj0KCQjwvIT5BRCqARIsAAwwD-QmETT-ko07ote5VQgodKvWU0uDG8GYN7Vj-6WVBBOWdSgPaPd9azAaAhVLEALw_wcB |
Red LED | Digikey | LXM3-PD01 | LED LUXEON REBEL DEEP RED SMD. Uses "Saber 20 mm Star base" https://www.digikey.com/products/en?keywords=1416-1701-1-nd |
Sandpaper | Amazon | B002NEV6GS | 3M Wetordry Sandpaper, 03022, 800 Grit, 3 2/3 inch x 9 inch. https://www.amazon.com/3M-03022-Imperial-Wetordry-Sandpaper/dp/B002NEV6GS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=3M+Imperial+Wetordry+3-2%2F3+in.+x+9+in.+800+Grit+Sandpaper+Sheets+%2810+Sheets-Pack%29&qid=1594435012&sr=8-1 |
Solder for soldering wires and circuit components | Amazon | Mudder Lead Free Solder Wire Sn99 Ag0.3 Cu0.7 with Rosin Core for Electrical Soldering 0.22lbs (0.6 mm) | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Mudder-Solder-Electrical-Soldering-0-22lbs/dp/B01B61TWGY |
Solder-able Breadboard for building the circuit | Amazon | GK1007 | Gikfun Solder-able Breadboard Gold Plated Finish Proto Board PCB Diy Kit for Arduino (Pack of 5PCS) GK1007. https://www.amazon.com/gp/product/B071R3BFNL/ref=oh_aui_detailpage_o04_s00?ie=UTF8&psc=1 |
Spade drill bit | Amazon | Irwin 88811 | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Speedbor%C2%AE-Blue-GrooveTM-Standard-Length-Woodboring/dp/B017S9JXB2/ref=sr_1_10?ie=UTF8&qid=1519516560&sr=8-10&keywords=11%2F16+spade+bit |
Transistor | Newark | 2N2222A | Can buy from many places. http://www.newark.com/nte-electronics/2n2222a/bipolar-transistor-npn-40v-to/dp/10M4197 |
Voltage regulator | Newark | LM317T | Equivilent to NTE956. https://www.newark.com/stmicroelectronics/lm317t/adjustable-linear-regulator-1/dp/89K0685?gclid=CjwKCAiAu9vwBRAEEiwAzvjq-1rmUi6lvOIFFt-BxttHXvmAeUoni4NM0BW-BtM_LMliSqxA9Xq4KxoCfikQAvD_BwE&mckv=sQqHZDDRz_dc|pcrid|219869297712|plid||kword|lm317t|match|p|slid||product||pgrid|35966450488|ptaid|kwd-541160713|&s_kwcid=AL!8472!3!219869297712!p!!g!!lm317t&CMP=KNC-GUSA-SKU-MDC |
Windows 10 tablet | Amazon | B08BYTT79Y | Any Windows 10 PC will do. https://www.amazon.com/gp/product/B08BYTT79Y/ref=ppx_yo_dt_b_asin_title_o01_s00?ie=UTF8&psc=1 |
Cell Culture Reagents | |||
Human Embryonic Kidney 293 cells HEK293 | ATCC | ATCC CRL-1573 | Common Cell line. https://www.atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | These are very common and there are many equivalents. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079#/26140079 |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose | ThermoFisher | 11965−092 | These are very common and there are many equivalents. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965118?SID=srch-srp-11965118#/11965118?SID=srch-srp-11965118 |
10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | These are very common and there are many equivalents. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122#/15140122?SID=srch-srp-15140122 |
White Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates | ThermoFisher | 07-200-589 | White plates are preferred. Do not use clear plates. https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates-8/p-152852 |
PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | PolySciences | 24765-1 | Can be replaced with another transfection reagent. https://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/transfection-reagents/polyethylenimine-max-mw40000-high-potency-linear-pei/ |
Name of Equipment | |||
Diagonal Cutting Plier (110mm) | Amazon | Proskit 1PK-037S | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y/ref=sr_1_11?dchild=1&keywords=diagonal+cutting+pliers&qid=1594436230&sr=8-11 |
Dremil 3000 with cutting tool and grinder | Amazon | Dremel 3000 | Dremel 3000-2/28 Variable Speed Rotary Tool Kit- 1 Attachments & 28 Accessories- Grinder, Sander, Polisher, Router, and Engraver. https://www.amazon.com/Dremel-3000-2-28-Attachments-Accessories/dp/B005JRJE7Y/ref=sr_1_3?dchild=1&keywords=Dremel+200-1%2F15+Two-Speed+Rotary+Tool+Kit&qid=1594436404&s=hi&sr=1-3 |
Dremil cutting and grinding tool | Amazon | Dremel 200-1/15 | Any similar Dremil will work. https://www.amazon.com/Dremel-200-1-Two-Speed-Rotary-Tool/dp/B002BAHF8W/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268058&sr=1-1&keywords=dremel+200&dpID=41h9ZucnTYL&preST=_SY300_QL70_&dpSrc=srch |
Dremil grinding tip | Amazon | Dremel 84922 | Silicon Carbide Grinding Stone. https://www.amazon.com/Dremel-84922-Silicon-Carbide-Grinding/dp/B00004UDKD/ref=sr_1_fkmr0_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268585&sr=1-1-fkmr0&keywords=dremel+tip+84922 |
EDSYN The Original Deluxe SOLDAPULLT | Amazon | DS017 | For removing solder/mistakes. https://www.amazon.com/EDSYN-The-Original-Deluxe-SOLDAPULLT/dp/B006GOKVKI |
Helping Hand with Magnifying Glass | Amazon | SE MZ101B | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/SE-MZ101B-Helping-Magnifying-Glass/dp/B000RB38X8/ref=sr_1_4?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268108&sr=1-4&keywords=Helping+hands&dpID=31GEhMw7WvL&preST=_SX300_QL70_&dpSrc=srch |
Pointed Nose Micro Pliers | Amazon | Hakko CHP PN-20-M | Steel Super Specialty Pointed Nose Micro Pliers with Smooth Jaws, 1.0mm Nose. https://www.amazon.com/Hakko-PN-20-M-Specialty-Pointed-Pliers/dp/B00FZPGUBI/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268153&sr=1-1&keywords=Hakko+CHP+PN-20-M+Steel+Super+Specialty+Pointed+Nose+Micro+Pliers+with+Smooth+Jaws%2C+1.0mm+Nose&dpID=3109XRgwn3L&preST=_SX342_QL70_&dpSrc=srch |
Small screw drivers | Amazon | Wiha 26197 | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/26197-Precision-Slotted-Phillips-Screwdrivers/dp/B01L46TEN2/ref=sr_1_1?s=hi&ie=UTF8&qid=1519268018&sr=1-1&keywords=Wiha+precision+set |
Soldering iron | Amazon | Yihua 939D+ Digital Soldering Station | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Professional-Digital-Soldering-Station-Switch/dp/B07YSCBZ4F/ref=psdc_13837391_t1_B07RVMZNYR |
TraceTech No-Clean Flux Pen | Amazon | 2507-N | Tech Spray 2507-N No-Clean Flux Dispensing Pen, 11.5 mL. https://www.amazon.com/Tech-Spray-2507-N-No-Clean-Dispensing/dp/B00DDF2FYS/ref=sr_1_1?dchild=1&keywords=2507-N&qid=1595469618&sr=8-1 |
Weller WSA350 120v Bench Top Smoke Absorber | Amazon | WSA350 | For soldering safety. https://www.amazon.com/Weller-WSA350-Bench-Smoke-Absorber/dp/B000EM74SK |
Wire strippers | Amazon | CSP-30-7 | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/Hakko-CSP-30-7-Stripper-Maximum-Capacity/dp/B00FZPHY7M/ref=psdc_553398_t5_B00FZPHMUG |
IWISS IWS-3220M Micro Connector Pin Crimping Tool 0.03-0.52mm² 32-20AWG | Amazon | IWS-3220M | These are very common and there are many equivalents. https://www.amazon.com/gp/product/B078WPT5M1/ref=ppx_yo_dt_b_search_asin_title?ie=UTF8&psc=1 |