Een adipocytencelkweekmodel om de impact van eiwit- en micro-RNA-modulatie op de adipocytenfunctie te bestuderen
Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd om oligonucleotiden zoals klein-interfererend RNA (siRNA), micro-RNA-mimics (miRs) of anti-micro-RNA (anti-miR) af te leveren in volwassen adipocyten om eiwit- en micro-RNA-expressie te moduleren.
Abstract
Verandering van de adipocytenfunctie draagt bij aan de pathogenese van metabole ziekten, waaronder diabetes type 2 en insulineresistentie. Dit benadrukt de noodzaak om het moleculaire mechanisme dat betrokken is bij adipocytendisfunctie beter te begrijpen om nieuwe therapieën tegen obesitasgerelateerde ziekten te ontwikkelen. Het moduleren van de expressie van eiwitten en micro-RNA’s di adipocyten blijft zeer uitdagend. Dit artikel beschrijft een protocol om murine fibroblasten te differentiëren in volwassen adipocyten en om de expressie van eiwitten en micro-RNA’s in volwassen adipocyten te moduleren door middel van omgekeerde transfectie met behulp van klein-interfererend RNA (siRNA) en micro-RNA nabootsen (miR mimic) oligonucleotiden. Dit omgekeerde transfectieprotocol omvat de incubatie van het transfectiereagens en de oligonucleotiden om een complex te vormen in de celkweekplaat waaraan de volwassen adipocyten worden toegevoegd. De adipocyten mogen zich vervolgens opnieuw hechten aan het aanhangen van plaatoppervlak in aanwezigheid van het oligonucleotiden /transfectiereagenscomplex. Functionele analyses zoals de studie van insulinesignalering, glucoseopname, lipogenese en lipolyse kunnen worden uitgevoerd op de getransfecteerde 3T3-L1 volwassen adipocyten om de impact van eiwit- of micro-RNA-manipulatie op de adipocytenfunctie te bestuderen.
Introduction
Obesitas wordt beschouwd als een belangrijke risicofactor voor tal van stofwisselingsziekten, waaronder insulineresistentie (IR), diabetes type 2 (T2D) en hart- en vaatziekten1. De huidige therapieën zijn er niet in geslaagd om de voortdurend stijgende prevalentie van deze ziekten te stoppen, en het beheer van de IR van obese en diabetische patiënten blijft een belangrijk klinisch probleem. Vetweefsel speelt een cruciale rol bij de controle van energiehomeostase en de pathologische expansie tijdens obesitas draagt bij aan de ontwikkeling van IR en T2D2,3. Dit benadrukt de noodzaak om het moleculaire mechanisme dat betrokken is bij adipocytendisfunctie beter te begrijpen om nieuwe therapieën tegen obesitasgerelateerde ziekten te ontwikkelen. Veel onderzoeken hebben de rol van eiwitcoderende RNA’s in de adipocytenfysiologie en hun associatie met obesitas onderzocht.
Meer recent heeft de ontdekking van niet-coderende RNA’s (ncRNA’s), met name micro-RNA’s (miRs), nieuwe concepten gesmeed met betrekking tot het mechanisme van de regulatie van genexpressieprogramma’s. Studies hebben aangetoond dat ncRNA’s belangrijke regulatoren zijn van de adipocytenfunctie en dat hun ontregeling een belangrijke rol speelt bij stofwisselingsziekten4. De manipulatie van eiwitten en ncRNA’s in adipocyten is dus cruciaal om hun rol in de adipocytenfunctie en hun impact op pathologieën zoals T2D te ontcijferen. Het manipuleren van de expressie van eiwitten en ncRNA’s in vivo en in primaire adipocyten blijft echter zeer uitdagend, wat het gebruik van in vitro adipocytenmodellen bevordert.
Murine 3T3-L1 fibroblasten differentiëren gemakkelijk in volwassen, functionele en insuline-responsieve adipocyten, die een goed gekarakteriseerde cellijn zijn die wordt gebruikt om de adipocytenfunctie te bestuderen (bijv. Insulinesignalering, glucoseopname, lipolyse en adipokines-secretie)5,6,7,8,9,10. Deze eigenschappen maken 3T3-L1-adipocyten een aantrekkelijk model om de expressie van eiwitcoderende en nc-RNA’s te moduleren om hun rol in de adipocytenfunctie en hun potentiële rol bij obesitasgerelateerde ziekten te ontcijferen. Helaas, terwijl 3T3-L1 fibroblasten gemakkelijk te transfecteren zijn met behulp van in de handel verkrijgbare reagentia, zijn gedifferentieerde 3T3-L1-adipocyten een van de moeilijkste cellijnen om te transfecteren. Dit is de reden waarom talrijke studies die genexpressie in 3T3-L1-cellen manipuleren, zich hebben gericht op adipocytendifferentiatie in plaats van op de adipocytenfunctie.
Lange tijd was de enige efficiënte techniek om adipocyten te transfecteren elektroporatie5, wat vervelend en duur is en celschade kan veroorzaken. Dit artikel rapporteert een omgekeerde transfectietechniek met behulp van een gemeenschappelijk transfectiereagens, dat de hands-on tijd voor transfectie vermindert, geen effect heeft op de levensvatbaarheid van cellen en veel goedkoper is dan elektroporatie. Dit protocol is perfect geschikt voor de transfectie van siRNA en andere oligonucleotiden zoals micro-RNA-mimics (miR-mimics) en anti-miRs. Het principe van het reverse-transfectieprotocol is om het transfectiereagens en de oligonucleotiden te incuberen om een complex in de celkweekplaat te vormen en vervolgens de volwassen adipocyten in de putten te zaaien. Vervolgens hechten de adipocyten zich opnieuw aan het aanhangen van het plaatoppervlak in aanwezigheid van het oligonucleotiden / transfectiereagenscomplex. Deze eenvoudige, efficiënte en goedkope methodologie maakt het mogelijk om de rol van eiwitcoderende RNA’s en miRs in de adipocytenfunctie en hun potentiële rol bij obesitasgerelateerde ziekten te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor de differentiatie en transfectie van volwassen adipocyten. Deze omgekeerde transfectiemethode is een eenvoudige, economische en zeer efficiënte methode om oligonucleotiden zoals, maar niet beperkt tot, siRNA’s, micro-RNA-nabootsingen en anti-micro-RNA’s te transfecteren in 3T3-L1-adipocyten, wat een van de moeilijkste cellijnen is om te transfecteren. Deze methode heeft enkele beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden. Dit protocol is niet efficiënt voor t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door INSERM, de Université Côte d’Azur en het Franse Nationale Onderzoeksagentschap (ANR) via het programma Investments for the future Laboratory of Excellence (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) en Initiative of Excellence (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. wordt ondersteund door subsidies van de Société Francophone du Diabète (SFD), de Association Française d’Etude et de Recherche sur l’Obésité (AFERO), het Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) en de Fondation Benjamin-Delessert. J.G. wordt ondersteund door ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. wordt ondersteund door ANR-subsidie ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 en een subsidie van de Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). We danken ook de Imaging Core Facility van C3M, gefinancierd door de Conseil Départemental des Alpes-Maritimes en de Région PACA, die ook wordt ondersteund door het GIS IBiSA Microscopy and Imaging Platform Côte d’Azur (MICA).
Materials
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
Riferimenti
- Klöting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
- Blüher, M. Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).
- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Vergoni, B., et al. DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Berthou, F., et al. The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions. Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).
- Ceppo, F., et al. Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages. Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).
- Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -. F. Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Hart, M., et al. miR-34a as hub of T cell regulation networks. Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).
- Brandenburger, T., et al. MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain. Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).
