Summary
Burada sunulan, protein ve mikro-RNA ekspresyonunun modüle etmek için küçük müdahaleci RNA (siRNA), mikro-RNA mimikleri (miRs) veya anti-mikro-RNA (anti-miR) gibi oligonükleotidleri olgun adipositlere ulaştırmak için bir protokoldür.
Abstract
Adiposit fonksiyonunun değiştirilmesi Tip 2 diyabet ve insülin direnci de dahil olmak üzere metabolik hastalıkların patogenezine katkıda bulunur. Bu, obeziteye bağlı hastalıklara karşı yeni tedaviler geliştirmek için adiposit disfonksiyonunda yer alan moleküler mekanizmayı daha iyi anlama ihtiyacını vurgulamaktadır. Adipositlerde proteinlerin ve mikro RNA'ların ekspresyonunun modülei son derece zorlu olmaya devam etmektedir. Bu makalede, murine fibroblastları olgun adipositlere ayırt etmek ve küçük müdahaleci RNA (siRNA) ve mikro RNA taklit (miR mimik) oligonükleotidler kullanarak ters transfeksiyon yoluyla olgun adipositlerdeki proteinlerin ve mikro RNA'ların ekspresyonunu modüle etmek için bir protokol açıklanmaktadır. Bu ters transfeksiyon protokolü, olgun adipositlerin eklenme hücre kültürü plakasında bir kompleks oluşturmak için transfeksiyon reaktifinin ve oligonükleotidlerin inkübasyonunu içerir. Adipozitlerin daha sonra oligonükleotidler/ transfeksiyon reaktif kompleksinin varlığında yapışan plaka yüzeyine yeniden dikilmesine izin verilir. Protein veya mikro-RNA manipülasyonunun adiposit fonksiyonu üzerindeki etkisini incelemek için transfected 3T3-L1 olgun adipositler üzerinde insülin sinyali, glikoz alımı, lipogenez ve lipoliz çalışması gibi fonksiyonel analizler yapılabilir.
Introduction
Obezite, insülin direnci (IR), Tip 2 Diyabet (T2D) ve kardiyovasküler hastalıklar1dahil olmak üzere çok sayıda metabolik hastalık için önemli bir risk faktörü olarak kabul edilir. Mevcut tedaviler bu hastalıkların sürekli yükselen yaygınlığını durduramadı ve obez ve diyabetik hastaların IR'lerinin yönetimi önemli bir klinik konu olmaya devam ediyor. Yağ dokusu enerji homeostazının kontrolünde çok önemli bir rol oynar ve obezite sırasında patolojik genişlemesi IR ve T2D2,3gelişimine katkıda bulunur. Bu, obeziteye bağlı hastalıklara karşı yeni tedaviler geliştirmek için adiposit disfonksiyonunda yer alan moleküler mekanizmayı daha iyi anlama ihtiyacını vurgulamaktadır. Birçok araştırma çalışması protein kodlayan RNA'ların adiposit fizyolojislerindeki rolünü ve obezite ile ilişkisini araştırmıştır.
Daha yakın zamanlarda, kodlamayan RNA'ların (ncRNA'lar), özellikle mikro RNA'ların (MIR'ler) keşfi, gen ekspresyon programlarının düzenleme mekanizmasıyla ilgili yeni kavramlar ortaya çıkarmıştır. Çalışmalar, ncRNA'ların adiposit fonksiyonunun önemli düzenleyicileri olduğunu ve düzensizliklerinin metabolik hastalıklarda önemli bir rol oynadığını göstermiştir4. Bu nedenle, adipositlerdeki proteinlerin ve ncRNA'ların manipülasyonu, adiposit fonksiyonundaki rollerini ve T2D gibi patolojiler üzerindeki etkilerini çözmek için çok önemlidir. Bununla birlikte, in vivo proteinlerin ve ncRNA'ların yanı sıra birincil adipozitlerde ekspresyonunun manipüle edilmesi, in vitro adiposit modellerinin kullanımını destekleyen son derece zorlu olmaya devam etmektedir.
Murine 3T3-L1 fibroblastları, adiposit fonksiyonunu incelemek için kullanılan iyi karakterize edilmiş bir hücre hattı olan olgun, fonksiyonel ve insülin duyarlı adipositlere kolayca farklılaşır (örneğin, insülin sinyali, glikoz alımı, lipoliz ve adipokines salgısı)5,6,7,8,9,10. Bu özellikler, 3T3-L1 adipositlerini, adiposit fonksiyonundaki rollerini ve obeziteye bağlı hastalıklardaki potansiyel rollerini çözmek için protein kodlama ve nc-RNA'ların ekspresyonunu modüle etmek için çekici bir model haline getirir. Ne yazık ki, 3T3-L1 fibroblastların ticari olarak mevcut reaktifler kullanılarak transfect'i kolayken, farklılaştırılmış 3T3-L1 adipositler transfect için en zor hücre çizgilerinden biridir. Bu nedenle 3T3-L1 hücrelerinde gen ekspresyonunu manipüle eden çok sayıda çalışma, adiposit fonksiyonu yerine adiposit farklılaşmasına odaklanmıştır.
Uzun bir süre boyunca, adipositleri transfect etmek için tek etkili teknik elektroporasyon5, sıkıcı, pahalı ve hücre hasarına neden olabilir. Bu makale, transfeksiyon için uygulamalı zamanı azaltan, hücre canlılığı üzerinde hiçbir etkisi olmayan ve elektroporasyondan çok daha ucuz olan ortak bir transfeksiyon reaktifi kullanarak ters transfeksiyon tekniğini rapor eder. Bu protokol, siRNA ve mikro-RNA mimikleri (miR mimikleri) ve anti-miR'ler gibi diğer oligonükleotidlerin transfeksiyonu için mükemmel bir şekilde uygundur. Ters transfeksiyon protokolünün prensibi, transfeksiyon reaktifini ve oligonükleotidleri kuluçkaya yatırarak hücre kültürü plakasında bir kompleks oluşturmak ve daha sonra olgun adipositleri kuyulara tohumlamaktır. Daha sonra, adipositler oligonükleotidler / transfeksiyon reaktif kompleksinin varlığında yapışan plaka yüzeyine yeniden yapışır. Bu basit, verimli ve ucuz metodoloji, protein kodlayan RNA'ların ve MIR'lerin adiposit fonksiyonundaki rolünün ve obeziteye bağlı hastalıklardaki potansiyel rollerinin incelenmesine izin vermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Protokolün tüm adımlarını laminer akış hücresi kültür başlığında gerçekleştirmek için steril teknikler kullanın. Tüm reaktifler ve ekipmanlar hakkında ayrıntılı bilgi için Malzeme Tablosu'nu görün.
1. Murine 3T3-L1 fibroblastlarının adipositlere farklılaştırılması
- 3T3-L1 fibroblastlarını kültür orta-DMEM'de 100 mm'lik yemeklerde piruvatsız, 25 mM glikoz, %10 yenidoğan baldır serumu ve %1 penisilin ve streptomisinin yetiştirin (Şekil 1A). Bulaşıkları bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin (%7 CO2 ve 37 °C).
- Birleşmesinden iki gün sonra, kültür ortamını değiştirin, piruvatsız DMEM ile değiştirin, 25 mM glikoz, %10 fetal baldır serumu (FCS) ve %1 penisilin ve streptomisin 0.25 mM 3-İzobutil-1-metilksantin (IBMX), 0.25 μM deksametason, 5 μg/mL insülin ve 10 μM rosiglitazone ile desteklenmiştir.
NOT: Hücreler 100 mm çanak başına 300.000 hücrede tohumlandığında izdiah süresine ulaşmak 5 gün sürer. - İki gün sonra, kültür ortamını piruvatsız DMEM, 25 mM glikoz, % 10 FCS ve 5 μg / mL insülin ve 10 μM rosiglitazon ile desteklenmiş% 1 penisilin ve streptomisin ile değiştirin ve 2 gün boyunca kuluçkaya yatırın. Daha sonra, hücreleri her 2 günde bir DMEM ile piruvatsız, 25 mM glikoz, % 10 FCS ve% 1 penisilin ve streptomisinin olmadan besleyin (Şekil 1B).
- 3T3-L1 adipositlerini farklılaşma protokolünün başlangıcından 7-8 gün sonra transfect.
NOT: Transfeksiyondan sonra kalan fibroblastların çoğalmasını önlemek için transfeksiyondan önce yüksek bir farklılaşma seviyesine (%>80) ulaşmak önemlidir, bu da sonuçları önyargılı hale getirecek karışık bir hücre popülasyonu sağlar.
2. Ön kaplamalı plakaların hazırlanması
- Transfeksiyondan bir gün önce veya birkaç saat önce, 1 mg / mL'deki bir stok çözeltisinden% 30 etanolde 100 μg / mL'de bir kolajen tipi I çözeltisi hazırlayın. 12 kuyu plakasının kuyusu başına 250 μL ve 24 kuyu plakasının kuyusu başına 125 μL ekleyin ve çözeltiyi kuyunun yüzeyine yayın.
- Kollajen kuruyana kadar plakayı kültür kaputunun altında kapaksız bırakın. Dulbecco'nun fosfat tamponlu saliniyle (D-PBS) iki kez yıkayın.
NOT: Önceden kaplanmış plakalar satın alınabilir.
3. Transfeksiyon karışımının hazırlanması
NOT: SiRNA'nın son konsantrasyonu 1 ila 100 nM arasındadır (12 kuyu plakasının kuyusu başına 1 ila 100 pmol siRNA). MiR mimikinin son konsantrasyonu 10 nM'dir (10 pmol/well). Hedef dışı etkileri önlemek için deneye başlamadan önce her bir siRNA, miR mimik veya diğer oligonükleotidlerin en iyi konsantrasyonunu belirleyin. Sonuçların istatistiksel analizini kolaylaştırmak için üç taraflı transfeksiyon deneyleri yapın. Pipetleme sırasında normal kaybı hesaba katmak için tüm reaktifleri fazla olarak hazırlayın.
- SiRNA'yı (veya diğer oligonükleotidleri) geliştirilmiş Minimal Essential Medium(Tablo 1)ile pipetleme (hacim/hacim) ile karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatır.
- Transfeksiyon reaktifini ve geliştirilmiş Minimal Esansiyel Ortamı siRNA'ya ekleyin ve karıştırmak için pipet ekleyin (Tablo 1). Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatır (bu süre zarfında bölüm 4'e geçin). Kollajen kaplı plakanın her kuyusuna transfeksiyon karışımını ekleyin.
4. 3T3-L1 adipositlerin hazırlanması
- 100 mm Petri kabındaki hücreleri D-PBS ile iki kez yıkayın. Hücrelere 5x tripsin ekleyin (100 mm çanak başına 1 mL), tüm yüzeyi tripsinle kapladiğinizden emin olun. 30 s bekleyin ve trypsin'i dikkatlice çıkarın.
- Petri kabını inkübatörde 37 °C'de 5-10 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri ayırmak için 100 mm'lik çanağa dokunun.
- Tripini nötralize etmek için piruvatsız 10 ml DMEM, 25 mM glikoz, % 10 FCS ve% 1 penisilin ve streptomisin ekleyin. Hücreleri ayırmak ve hücre süspansiyonu homojenize etmek için ortamı dikkatlice yukarı ve aşağı borun.
- Bir Malassez sayım odası veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve hücrelerin konsantrasyonu 6,25 x 105 hücre /mL orta olarak ayarlayın. Transfeksiyon karışımını içeren 12 kuyulu bir plakanın (5 x 105 hücre) hücre süspansiyonunun/kuyusunun 800 μL'si veya 24 kuyulu bir plakanın (2,5 x 105 hücre) 400 μl'si.
NOT: Bir adet 100 mm'lik Petri adipozit kabı, bir adet 12 kuyu plakasının veya bir adet 24 kuyu plakasının hazırlanmasına izin verecektir. 100 mm'lik bir tabak genellikle 12 kuyu plakasının kuyusu başına 5 x 10 5 adipositlere karşılık gelen6-7 x 106 adiposit içerir. - Plakaları bir hücre kültürü inkübatöründe (%7 CO2 ve 37 °C) kuluçkaya yatırın ve hücreleri 24 saat boyunca rahatsız etmeyin. Ertesi gün, süpernatantı piruvatsız taze DMEM, 25 mM glikoz,% 10 FCS ve% 1 penisilin ve streptomisinin ile dikkatlice değiştirin.
NOT: Hücreleri kollajen ön kaplamalı 48 ve 96 kuyu plakalarına tohumlamak da mümkündür, ancak adipositlerin kopmasını önlemek için ortamı değiştirirken daha fazla önlem alın.
5. Transfected 3T3-L1 adipositlerin fonksiyonel analizi
- MRNA ve protein için siRNA veya miR mimik doğumundan sonra sırasıyla 24-48 saat ve 48-96 saat çalışma hedefi nakavt.
- İnsülin sinyali, glikoz alımı, adipokin salgılama, lipoliz ve lipogenez incelemek için transfected adipositlerin fonksiyonel analizlerini gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3T3-L1 adipositlerdeki proteinlerin veya mikro RNA'ların ekspresyonunu modüle etmek için burada açıklanan ters transfeksiyon prosedürünü kullanarak, adipositlerin transfeksiyondan sonra morfolojilerini korudukları gösterilmiştir (Şekil 1B,C). Gerçekten de, transfeksiyondan 2 gün sonra, adipositler iyi yayılmış ve plakaya tutturulmuş ve olgun 3T3-L1 adipositlerin bir özelliği olan çok damarlı lipit damlacıkları sunulmuştur. Lipid içeriği transfected ve transfected olmayan adipositler arasında farklı değildi (Şekil 1D, E). Ayrıca, peroksiom proliferatörle aktive reseptör gama 2 (Pparφ2), adiponektin (Adipoq),glikoz taşıyıcı 4 veya çözünen taşıyıcı aile 2 üyesi gibi farklılaşma belirteçlerinin mRNA ifadesi 4 (Slc2a4), insülin reseptör substratı 1 (Irs1), perilipin-1 (Plin1) transkripsiyonlu hücrelerde transktive olmayan adipositlere kıyasla değişmedi (Şekil 1F). Bu ters transfeksiyon protokolü, adipositlerin % 70'i trans enfekte olduğu için > verimlidir (Şekil 1G,H).
Perilipin-1, lipid damlacık oluşumunu teşvik etmek ve lipolizi inhibe etmek için bilinen adiposit spesifik bir proteindir. Burada, 3T3-L1 adipositleri Plin1'e (si-PLIN1) karşı çırpılmış siRNA (si-SCR) veya siRNA ile trans enfekte edildi. Si-PLIN1 ile transfeksiyondan üç gün sonra, Plin1'in mRNA seviyesi% 70 (Şekil 2A) ve protein seviyesi% 63 (Şekil 2B, C)azalmıştı. PLIN1 ekspresyonu transeksiyondan 4 gün sonra floresan mikroskopi ile de analiz edilmiş ve kontrol adipositlerindeki ifadesine göre %92 oranında azaldığı bulunmuştur (Şekil 2D-F), böylece hem transfeksiyon protokolünün hem de si-PLIN1'in etkinliğini göstermiştir.
Bu protokol ayrıca miR-34a(Şekil 3A)ifadesini canlandırmak için mikro RNA taklit (miR mimikleri) oligonükleotidler ile adipositlerin ters transfeksiyonunu gerçekleştirmek için de kullanılmıştır. MiR-34a'nın aşırı ekspresyonu VAMP2 protein ekspresyonunun% 50 azalmasına yol açtı (Şekil 3B, C), miR-34a 11,12'nindoğrulanmış bir hedefi. Son olarak, bu çalışma 3T3-L1 adipositlerin ters transfeksiyonunun işlevlerini ve insülin stimülasyonuna yanıt vermelerini koruduğunu göstermektedir. Nitekim, Plin1'in 3T3-L1 adipositlerinde devrilmesi bazal lipolizde artışa yol açmıştır (Şekil 4A). Ayrıca, miR-34a'nın 3T3-L1 adipositlerde aşırı ekspresyonu, insülin kaynaklı protein kinaz B fosforilasyonu (Şekil 4B, C) ve glikoz alımının inhibisyonuna yol açmıştır ( Şekil4D).
Şekil 1: 3T3-L1 fibroblastların olgun adipozitlere farklılaşması. (A) 3T3-L1 fibroblastlar 100 mm çanak başına 3 x10 5 hücre yoğunluğunda tohumlandı. 2 gün sonra 3T3-L1 fibroblastlarının temsili 10x parlak alan görüntüsü. (B) Konfluenslerden iki gün sonra (0. gün), 3T3-L1 fibroblastları 4 gün boyunca (4. güne kadar) farklılaşma kokteyl karışımı kullanılarak adipozitlere farklılaştırıldı. Adipositlere farklılaştırılmış 3T3-L1 fibroblastların temsili 10x parlak alan görüntüsü (gün 7). Çok damarlı lipid damlacıklı adipositler kolayca ayırt edilebilir. (C) 3T3-L1 adipositleri 7. Transfected 3T3-L1 adipositlerinin temsili 10x brightfield görüntüleri (gün 9). Transfected adipositlerin morfolojisi, transktaklı olmayan adipositlerle karşılaştırılabilir, transfeksiyon yönteminin yumuşak olduğunu ve adipositler için toksik olmadığını ima eder. Ölçek çubukları: 50 μm. (D–E) 3T3-L1 adipositler 7. günde si-SCR ile trans enfekte edildi (üst paneller); transkine olmayan adipositler (alt paneller). İki gün sonra, hücreler lipitleri lekelamak için Oil Red O ile kuluçkaya yatırıldı. (D) Plakadaki lekeli hücrelerin temsili görüntüleri ve temsili 10x brightfield görüntüleri gösterilir. Ölçek çubukları: 50 μm. (E) Hücrelere dahil edilen Yağ Kırmızı O, 2 propanol ile elde edildi ve spektrofotometre kullanılarak ölçüldü. Veriler, transkine olmayan hücrelerin emiciliği 1 olarak normalleştirilerek rastgele birimlerde ifade edilir. Sonuçlar üç bağımsız deneyin ortalaması + SEM'i olarak ifade edilir. İstatistiksel analiz Öğrenci'nin t-testi ile gerçeklendi. (F) 3T3-L1 adipositleri si-SCR ile transkred edildi. Transfeksiyondan üç gün sonra, hücreler toplam RNA'yı izole etmek için hasat edildi. Adiposit farklılaşma belirteçlerinin ekspresyasyonu qRT-PCR ile ölçüldü ve 36B4 RNA seviyeleri kullanılarak normalleştirildi. Veriler, transfected olmayan hücrelerdekine göre transfected hücrelerdeki mRNA ekspresyonunun (noktalı çizgi ile temsil edilen 1 olarak normalleştirilmiş) temsil ettiğini ve üç bağımsız deneyin ortalama + SEM'i olarak ifade edildiğini gösterir. İstatistiksel analiz Öğrenci'nin t-testi ile gerçeklendi. (G–H) 3T3-L1 adipositler si-SCR veya floresan boya (FAM) ile transkriptüde edildi ve kapak örtülerine kaplandı. 3T3-L1 adipositler floresan mikroskopi ile 8 saat sonra analiz edildi. (G) Transfected 3T3-L1 hücrelerinin temsili tek düzlemli görüntüsü gösterilmiştir. (H) FAM pozitif hücrelerin toplam hücre sayısına göre nicelemesi. Veriler floresan si-RNA içeren hücrelerin yüzdesi olarak ifade edilir. İstatistiksel analiz 0.0001< Mann-Whitney testi kullanılarak gerçeklenmiştır. Kısaltmalar: si-SCR = çırpılmış siRNA; SEM = ortalamanın standart hatası; qRT-PCR = nicel ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu; FAM = floresan amidit; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; si-FAM = FAM etiketli si-RNA. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 3T3-L1 adipositlerde protein susturma. 3T3-L1 adipositler Plin1'e (si-PLIN1) karşı çırpılmış si-RNA (si-SCR) veya si-RNA ile transkriptüde edildi. (A) Transfeksiyondan üç gün sonra Plin1'in mRNA ekspresyonu qRT-PCR ile ölçüldü. mRNA ekspresyonu 36B4 RNA seviyeleri kullanılarak normalleştirildi ve si-SCR ile tedavi edilen hücreler 1'e normalleştirilerek rastgele birimlerde ifade edildi. Sonuçlar dört bağımsız deneyin ortalama + SEM'i olarak ifade edilir. İstatistiksel analiz, Öğrenci t-testi, **p < 0.01 kullanılarak gerçek gerçekleştirildi. (B–C) Transfeksiyondan üç gün sonra, protein lysates PLIN1 ve HSP90'a (yükleme kontrolü) karşı yönlendirilen antikorlarla batı şişkinliğine maruz kaldı. Temsili immünoblotlar gösterilmiştir. (C) PLIN1 miktarı densitometri tarama analizi ile ölçüldü ve HSP90 miktarı kullanılarak normalleştirildi. Veriler, si-SCR ile tedavi edilen hücrelerin 1'e normalleştirilmesiyle rastgele birimlerde ifade edilir. Sonuçlar dört bağımsız deneyin ortalama + SEM'i olarak ifade edilir. İstatistiksel analiz Öğrenci t-testi kullanılarak yapıldı, *p < 0.05. (D–F) 3T3-L1 adipositler si-SCR veya si-PLIN1 ile trans enfekte edildi ve kapak örtülerine kaplandı. PLIN1 ekspresyâmı 96 saat sonra floresan mikroskopi ile analiz edildi. (D)Anti-perilipin antikor ve anti-tavşan-Alexa647-konjuge antikor ile boyanmış 3T3-L1 adipositlerin temsili tek düzlemli görüntüleri gösterilmiştir. Ölçek çubukları = 10 μm. (E) Ticari yazılım kullanılarak 3B olarak segmentlere ayrılmıştır 3T3-L1 adipositlerin üç boyutlu (3D) hacim işleme. Ölçek çubukları = 10 μm. (F) PLIN1 sinyal yoğunluğunun toplam hücre sayısına göre ölçülmesi. Veriler, si-SCR ile tedavi edilen hücrelerin% 100'e normalleştirilmesiyle rastgele birimlerde ifade edilir. İstatistiksel analiz 0.0001< Mann-Whitney testi kullanılarak gerçeklenmiştır. Kısaltmalar: si-SCR = çırpılmış siRNA; si-PLIN1 = Plin1'e karşı siRNA; Plin1 = perilipin-1; HSP90 = ısı şok proteini 90; SEM = ortalamanın standart hatası; qRT-PCR = nicel ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu; FAM = floresan amidit; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindole; IB = immünblotting. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 3T3-L1 adipositlerde mikro-RNA aşırı ifade. 3T3-L1 adipositler kontrol mikro-RNA mimik (miR-kontrol) veya mikro-RNA 34a mimik (miR-34a) ile transkred edildi. Transfeksiyondan üç gün sonra, hücreler (A) RNA ekstraksiyonu veya (B) protein lysates hazırlanması için hasat edildi. (A) miR-34a ifadesi qRT-PCR ile ölçüldü. MiR ekspresy kullanımı U6 küçük RNA seviyeleri kullanılarak normalleştirildi ve miR kontrolü ile tedavi edilen hücreler 1 olarak normalleştirilerek rastgele birimlerde ifade edildi. Sonuçlar üç bağımsız deneyin ortalaması + SEM'i olarak ifade edilir. İstatistiksel analiz Öğrenci t-testi kullanılarak yapıldı, *p < 0.05. (B) Protein lysates VAMP2 ve TUBULIN (yükleme kontrolü) aleyhine yönlendirilen antikorlar ile batı şişkinlik maruz kaldı. Üç bağımsız deneyin temsili immünoblotları gösterilmiştir. (C) VAMP2 miktarı densitometri tarama analizi ile ölçüldü ve TUBULIN miktarı kullanılarak normalleştirildi. Veriler, miR kontrol hücreleri 1 olarak normalleştirilerek rastgele birimler halinde ifade edilir. Sonuçlar üç bağımsız deneyin ortalaması + SEM'i olarak ifade edilir. İstatistiksel analiz Student's t-test, *p < 0.05 ile yapıldı. Kısaltmalar: SEM = ortalamanın standart hatası; qRT-PCR = nicel ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu; VAMP2 = vezikli ile ilişkili membran proteini 2; IB = immünblotting. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: 3T3-L1 adiposit fonksiyonunda protein veya mikro-RNA modülasyonunun etkileri. (A) 3T3-L1 adipositler si-SCR veya si-PLIN1 ile transkriptüde edildi. Ortam transeksiyondan 24 saat sonra değiştirildi ve bazal lipolizi ölçmek için 48 saat sonra toplandı. Sonuçlar, medyada (μg/mL) salınan gliserol ve dört bağımsız deneyin ortalama + SEM'i olarak ifade edilir. İstatistiksel analiz, Öğrenci t-testi, ***p < 0.001 kullanılarak gerçeklenmiştır. (B) 3T3-L1 adipositler miR-kontrol veya miR-34a ile transkr ile transkr edildi. Ortam transeksiyondan sonra 24 saat değiştirildi ve 48 saat sonra, ortam 6 saat boyunca tükenme ortamına (piruvatsız DMEM, 25 mM glikoz, % 1 penisilin ve streptomisin ve% 0.5 BSA) değiştirildi. Daha sonra hücreler 5 dakika boyunca 0.5 nM insülin ile tedavi edildi. Fosfo-PKB ve PKB'ye (yükleme kontrolü) karşı yönlendirilen antikorlarla batı şişkinliği için protein lysates hazırlamak için hücreler hasat edildi. Üç bağımsız deneyin temsili immünoblotları gösterilmiştir. (C) Fosfo-PKB miktarı densitometri tarama analizi ile ölçüldü ve toplam PKB miktarı kullanılarak normalleştirildi. Veriler, insülin ile tedavi edilen miR kontrol hücrelerinin 1'e normalleştirilmesiyle rastgele birimlerde ifade edilir. Sonuçlar üç bağımsız deneyin ortalaması + SEM'i olarak ifade edilir. İnsülin ile tedavi edilen miR kontrol hücrelerine kıyasla iki yönlü ANOVA testi, *p < 0.05 kullanılarak istatistiksel analiz yapıldı. (D) 3T3-L1 adipositler miR-kontrol veya miR-34a ile transkr ile transkr edildi. Ortam transfectiondan 24 saat sonra değiştirildi ve 48 saat sonra ortam 6 saat boyunca tükenme ortamına değiştirildi. Daha sonra hücreler 20 dakika boyunca 0.5 nM insülin ile tedavi edildi. (2-3H)deoksiglucose alımı 3 dk'nın üzerinde ölçüldü. Veriler, miR kontrolü ile tedavi edilen hücrelerdeki bazal glikoz alımı 1'e normalleştirilerek rastgele birimlerde ifade edilir. Sonuçlar üç bağımsız deneyin ortalaması + SEM'i olarak ifade edilir. İnsülin ile tedavi edilen miR kontrol hücrelerine kıyasla iki yönlü ANOVA testi, *p < 0.05 kullanılarak istatistiksel analiz yapıldı. Kısaltmalar: si-SCR = çırpılmış siRNA; si-PLIN1 = Plin1'e karşı siRNA; SEM = ortalamanın standart hatası; PKB = protein kinaz B; p-PKB = fosfor-PKB; miR-CTL = miR kontrolü; DMEM = Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium'ı; BSA = sığır serum albümin; ANOVA = varyans analizi; IB = immünblotting. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Kuyu başına (12 kuyu plakası) | Kuyu başına (24 kuyu plakası) | |
| Oligonükletitler | 20 μL | 10 μL |
| (si-RNA, miR...) | ||
| Geliştirilmiş Minimal Temel Ortam | 20 μL | 10 μL |
| Transfeksiyon reaktifi | 5,6 μL | 2,8 μL |
| Geliştirilmiş Minimal Temel Ortam | 154,4 μL | 77,2 μL |
| Transfeksiyon karışımının toplam hacmi | 200 μL | 100 μL |
Tablo 1: 12 kuyulu ve 24 kuyulu plaka formatları için transfeksiyon reaktifleri gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makale olgun adipositlerin farklılaşması ve transfeksiyon için ayrıntılı bir protokol sunun. Bu ters transfeksiyon yöntemi, siRNA'lar, mikro RNA mimikleri ve anti-mikro-RNA'lar gibi oligonükleotidleri transfect etmek için basit, ekonomik ve son derece verimli bir yöntemdir. Bu yöntemin dikkate alınması gereken bazı sınırlamaları vardır. Bu protokol plazmid DNA ile transfeksiyon için verimli değildir, bu da fonksiyon kazancı çalışmaları için bu tekniğin yararını sınırlar. 3T3-L1 hücre hattı da dahil olmak üzere murin hücre hatları tipik olarak in vitro adiposit fonksiyonunu incelemek için kullanılmış olsa da, mikro-RNA ekspresyon kalıpları ve murin dokusundaki aktiviteler genellikle insanlarda gözlenenlerden farklıdır; bu, birincil hücrelerde ve hücre satırlarında da böyledir. Ayrıca, 3T3-L1 fibroblastının adipozitlere farklılaşması için kullanılan ortam fizyolojik olmayan bir hormon kokteyli gerektirir (insülin, deksametazon, IBMX ve rosiglitazone) ve farklılaştırılmış hücreler morfolojik olarak in vivo olgun adipositlerden farklıdır: uniloküler lipid damlacık yerine multiloküler lipid damlacıkları sunarlar. Bu, in vitro ve in vivo çalışmalar arasındaki gen ekspresyonu ve hücresel yanıtlardaki bazı farklılıkları açıklayabilir.
Elektroporasyona kıyasla bu ters transfeksiyon protokolünü kullanmanın bir yararı, bu yöntemin daha ucuz olmasıdır. Gerçekten de, reaktifler daha ucuzdur ve ters transfeksiyonun yüksek verimliliği, ihtiyaç duyulan oligonükleotidlerin miktarlarını azaltır ve bir elektroporatör gibi pahalı ekipmanlara gerek yoktur. Ayrıca, daha düşük bir siRNA konsantrasyonu kullanmak, hedef dışı etkileri önledici olduğu için faydalıdır. Ayrıca, bu ters transfeksiyon, daha az hücre gerektiren ve elektroporasyona kıyasla mükemmel hücre canlılığı ve daha sağlam veriler sağlayacak kolay, hızlı, nazik ve basit bir transfeksiyon yöntemidir. Yukarıda ayrıntılı olarak açıklanan prosedür fare 3T3-L1 hücrelerinin farklılaşması ve ters transfeksiyon için optimize edilmiş olsa da, insan preadipositleri de adipositler5'e ayırt edilebilir ve bu protokol kullanılarak kolayca ters transfeksiyona tabi tutulabilir. Bu rapor, adipositlerin lipozomal olmayan bir amphiphile transfection reaktifinin yeni nesli kullanılarak ters transfeksiyondan sonra canlı, sağlıklı ve insüline duyarlı kaldığını göstermektedir. Ters transfeksiyon, diğer popüler transfeksiyon reaktifleri kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, iyi ifade modülasyonu ve hücre canlılığı üzerinde olumsuz bir etkisi olmaması için oligonükleotid ve transfeksiyon reaktifi miktarlarının optimize edilmesi gerekir.
Bu protokol, proteinlerin ve mikro RNA'ların adiposit işlevindeki rolünün incelenmesini kolaylaştırır, ancak lnc-RNA'lar, Y-RNA'lar veya eRNA'lar gibi diğer kodlamayan RNA'ları modüle etmek için de kullanılabilir. Protokolde yordamın verimliliğini etkileyebilecek kritik adımlar vardır. 3T3-L1 fibroblastların adipozitlere farklılaşması dikkatle izlenmelidir. Transfeksiyondan sonra kalan fibroblastların çoğalmasını önlemek için yüksek bir farklılaşma seviyesine ulaşmak önemlidir, bu da deneyin sonuçlarını önyargılı hale getirecektir. Bir diğer önemli nokta, yeni farklılaştırılmış olgun adipositler üzerinde transfeksiyonun gerçekleştirilmesidir; en iyi zamanlama, farklılaşma kokteylini çıkardıktan 3-4 gün sonrasına karşılık gelen farklılaşma protokolünün başlamasından 7-8 gün sonradır. Bu, sağlam transfeksiyon etkinliği sağlayacak ve adipositlerin plakaya iyi bir şekilde yeniden dikilmesini sağlayacaktır. Son olarak, adipositlerin hücrelere zarar vermeden ayrışmasını sağlamak için tripin ile adipositlerin tedavisi dikkatle izlenmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma INSERM, Université Côte d'Azur ve Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR) tarafından gelecekteki Mükemmellik Laboratuvarı yatırımları (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) ve Mükemmellik Girişimi (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001) programı aracılığıyla desteklenmiştir. J.J., Société Francophone du Diabète (SFD), Association Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) ve Fondation Benjamin-Delessert'in bağışlarıyla desteklenmektedir. J.G. ANR-18-CE14-0035-01 tarafından desteklenir. J-F.T., ANR hibesi ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 ve Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587) tarafından desteklenmektedir. Ayrıca Conseil Départemental des Alpes-Maritimes tarafından finanse edilen C3M Görüntüleme Çekirdek Tesisi ve CBS IBiSA Mikroskopi ve Görüntüleme Platformu Côte d'Azur (MICA) tarafından da desteklenen Région PACA'ya teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 well Tissue Culture Plate | Dutscher | 353043 | |
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | diluted to 5x with D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagen type I from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate |
| Ethanol | Sigma | 51976 | |
| FAM-labeled Negative Control si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antibody | Santa Cruz | sc-131119 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulin, Human Recombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA mimics | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010-159 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-056623-01-0005 | |
| Penicillin and Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antibody | Cell Signaling | 3470 | Dilution : 1/1000 |
| Petri dish 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antibody | Cell Signaling | 9272 | Dilution : 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | Dilution : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfection reagent (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| α-tubulin antibody | Sigma aldrich | T6199 | Dilution : 0.5 µg/mL |
| Vamp2 antibody | R&D Systems | MAB5136 | Dilution : 0.1 µg/mL |
References
- Klöting, N., et al.
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E. Enlarged subcutaneous abdominal adipocyte size, but not obesity itself, predicts type II diabetes independent of insulin resistance. Diabetologia. 43 (12), 1498-1506 (2000).
- Blüher, M. Adipose tissue dysfunction contributes to obesity related metabolic diseases. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 27 (2), 163-177 (2013).
- Lorente-Cebrián, S., González-Muniesa, P., Milagro, F. I., Martínez, J. A. MicroRNAs and other non-coding RNAs in adipose tissue and obesity: emerging roles as biomarkers and therapeutic targets. Clinical Science. 133 (1), 23-40 (2019).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Vergoni, B., et al. DNA damage and the activation of the p53 pathway mediate alterations in metabolic and secretory functions of adipocytes. Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).
- Berthou, F., et al. The Tpl2 kinase regulates the COX-2/prostaglandin E2 axis in adipocytes in inflammatory conditions. Molecular Endocrinology. 29 (7), 1025-1036 (2015).
- Ceppo, F., et al. Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages. Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).
- Jager, J., Grémeaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. -F. Interleukin-1beta-induced insulin resistance in adipocytes through down-regulation of insulin receptor substrate-1 expression. Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).
- Jager, J., et al. Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis. Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).
- Hart, M., et al. miR-34a as hub of T cell regulation networks. Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187 (2019).
- Brandenburger, T., et al. MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain. Neuroscience Letters. 708, 134365 (2019).
