Ковалентная маркировка диэтилпирокарбонатом для изучения структуры белка высшего порядка с помощью масс-спектрометрии
Summary
Описаны экспериментальные процедуры выполнения ковалентной маркировки на основе диэтилпирокарбоната с масс-спектрометрическим детектированием. Диэтилпирокарбонат просто смешивают с интересуемым белком или белковым комплексом, что приводит к модификации доступных растворителю аминокислотных остатков. Модифицированные остатки могут быть идентифицированы после протеолитического сбраживания и анализа жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии.
Abstract
Характеристика структуры белка более высокого порядка имеет важное значение для понимания его функции. Масс-спектрометрия (МС) стала мощным инструментом для этой цели, особенно для белковых систем, которые трудно изучать традиционными методами. Чтобы изучить структуру белка с помощью MS, в растворе проводят специфические химические реакции, которые кодируют структурную информацию белка в его массу. Одним из особенно эффективных подходов является использование реагентов, которые ковалентно модифицируют доступные растворителям боковые цепи аминокислот. Эти реакции приводят к увеличению массы, которое может быть локализовано с разрешением на уровне остатка в сочетании с протеолитическим сбраживанием и тандемной масс-спектрометрией. Здесь мы описываем протоколы, связанные с использованием диэтилпирокарбоната (DEPC) в качестве ковалентного реагента маркировки вместе с обнаружением РС. DEPC представляет собой высокоэлектрофильной молекулу, способную маркировать до 30% остатков в среднем белке, тем самым обеспечивая отличное структурное разрешение. DEPC успешно используется вместе с MS для получения структурной информации для небольших однодоменные белки, такие как β2-микроглобулин, к крупным многодоменные белки, такие как моноклональные антитела.
Introduction
Белки являются важными биомолекулами практически в каждом физиологическом процессе. Разнообразие функций, которые выполняют белки, возможно из-за структур, которые они принимают, и взаимодействий, которые они имеют с другими биомолекулами. Чтобы понять функцию белка на более глубоком уровне, необходимы биохимические и биофизические инструменты для выяснения этих важных структурных особенностей и взаимодействий. Традиционно рентгеновская кристаллография, криогенная электронная микроскопия и спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) обеспечивали желаемую детализацию на атомном уровне для выявления структуры белка. Однако многочисленные белковые системы не могут быть опрошены этими методами из-за плохого поведения кристаллизации, ограниченной доступности белка, чрезмерной гетерогенности образца или ограничений молекулярной массы. Следовательно, появились новые методы анализа, которые преодолевают эти ограничения. Среди новых методов, которые могут предоставить структурную информацию белка, является масс-спектрометрия.
Масс-спектрометрия (MS) измеряет отношение массы к заряду молекулы (m/z), поэтому структурная информация белка более высокого порядка должна быть получена путем кодирования желаемой структурной информации в массу белка. Было разработано несколько подходов к кодированию этой информации, включая водородно-дейтериевый обмен (HDX)1,2,3,4,химическое сшивание (XL)5,6и ковалентную маркировку (CL)7,8,9,10. В HDX магистральные амидные водороды обмениваются немного более массивными дейтериями со скоростью, которая зависит от доступности растворителей и степени H-связи. Степень HDX может быть локализована путем быстрого переваривания белка в пептидные фрагменты перед разделением и измерением этих фрагментов масс-спектрометром или путем диссоциации белка в эксперименте сверху вниз. Определение обменного курса дает дальнейшее понимание динамики белка. HDX оказался ценным инструментом для характеристики структуры белка, несмотря на проблемы, связанные с обратным обменом и необходимостью специализированного оборудования для максимизации воспроизводимости. В XL-MS белки реагируют с бифункциональными реагентами, которые ковалентно связывают соседние боковые цепи остатка внутри данного белка или между двумя белками. При этом XL-MS может обеспечить ограничения расстояния, которые могут быть использованы для характеристики структуры белка. Области белка, которые являются сшитыми, могут быть идентифицированы с помощью протеолитического пищеварения с последующим анализом жидкостной хроматографии (LC)-MS. В то время как XL-MS является универсальным инструментом, который использовался для изучения различных белковых комплексов, в том числе внутри клеток, идентификация продуктов XL является сложной задачей и требует специализированного программного обеспечения.
CL-MS появился в последнее время как дополнительный, а иногда и альтернативный инструмент на основе MS для изучения структуры и взаимодействий белка. В CL-MS белок или белковый комплекс ковалентно модифицируют монофункциональным реагентом, который может реагировать с боковыми цепями, подвергающимися воздействию растворителя(рисунок 1). Сравнивая степени модификации белка или белкового комплекса в различных условиях, можно выявить конформационные изменения, сайты связывания и белково-белковые интерфейсы. После реакции CL сайт-специфическая информация, часто на уровне одной аминокислоты, может быть получена с использованием типичных рабочих процессов протеомики снизу вверх, в которых белки протеолитически перевариваются, пептидные фрагменты разделяются LC, а модифицированные участки идентифицируются с использованием тандема MS (MS / MS). Богатая история химии биоконъюгатов сделала многочисленные реагенты доступными для экспериментов CL-MS. Реагенты CL делятся на две общие категории: (i) специфические и (ii) неспецифические. Специфические реагенты реагируют с одной функциональной группой (например, свободными аминами)8,10 и легко реализуются, но они, как правило, предоставляют ограниченную структурную информацию. Неспецифические реагенты реагируют с широким спектром боковых цепей, но часто требуют специализированного оборудования, такого как лазеры или синхротронные источники для получения этих высокореактивных видов. Гидроксильные радикалы являются наиболее часто используемым неспецифическим реагентом, поскольку были применены в гидроксильных радикалах (HRF)7,11,12,13 экспериментов для изучения широкого спектра белков и белковых комплексов в различных условиях.
Наша исследовательская группа успешно использовала другой относительно неспецифический реагент под названием диэтилпирокарбонат (DEPC) для изучения структуры и взаимодействий белка в контексте экспериментов CL-MS14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. DEPC предлагает простоту специфических реагентов маркировки (т.е. для выполнения реакций не требуется специализированное оборудование), реагируя при этом с 30% аминокислот в среднем белке. Как высокоэлектрофильный реагент, DEPC способен реагировать с N-концем и нуклеофильными боковыми цепями цистеина, гистидина, лизина, тирозина, серина и остатков треонина. Как правило, образуется один продукт этих реакций, в результате чего увеличивается масса на 72,02 Да. Этот единственный тип продукта контрастирует с 55 различными продуктами, которые могут быть получены, когда белки реагируют с гидроксильными радикалами7. Такая простая химия облегчает идентификацию маркированных участков.
Здесь мы предоставляем протоколы для использования CL-MS на основе DEPC для изучения структуры и взаимодействий белка. Описаны детали, связанные с препаратом реагента, реакциями DEPC-белка, условиями переваривания белка, параметрами LC-MS и MS/MS, а также анализом данных. Мы также демонстрируем полезность маркировки DEPC, приводя примеры результатов взаимодействия белка-металла, белка-лиганда и белка-белка, а также белков, претерпевающих структурные изменения при нагревании.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги
Для обеспечения надежных результатов маркировки следует учитывать несколько моментов, касающихся экспериментального проектирования. Во-первых, чтобы максимизировать маркировку белка, необходимо избегать буферов с сильно нуклеофильными группами (например, Tris…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают поддержку со стороны Национальных институтов здравоохранения (NIH) в рамках гранта R01 GM075092. Масс-спектрометр Thermo Orbitrap Fusion, используемый для получения некоторых данных, описанных здесь, был приобретен на средства Гранта Национального института здравоохранения S10OD010645.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 3448 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Millipore Sigma | M1254 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt | Millipore Sigma | M9381 | |
| Acclaim PepMap RSLC C18 Column | Thermo Scientific | 164537 | 300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-1 | |
| Diethylpyrocarbonate | Millipore Sigma | D5758 | |
| HPLC-grade water | Fisher Scientific | W5-1 | |
| Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
| Immobilized chymotrypsin | ProteoChem | g4105 | |
| Immobilized trypsin, TPCK Treated | Thermo Fisher Scientific | 20230 | |
| Iodoacetamide | Millipore Sigma | I1149 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine | Millipore Sigma | C4706 |
Riferimenti
- Katta, V., Chait, B. T., Carr, S. Conformational Changes in Proteins Probed by Hydrogen-exchange Electrospray-ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5, 214-217 (1991).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrometry Reviews. 25, 158-170 (2006).
- Pirrone, G. F., Iacob, R. E., Engen, J. R. Applications of hydrogen/deuterium exchange MS from 2012 to 2014. Analytical Chemistry. 87, 99-118 (2015).
- Oganesyan, I., Lento, C., Wilson, D. J. Contemporary hydrogen deuterium exchange mass spectrometry. Methods. 144, 27-42 (2018).
- Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25, 663-682 (2006).
- Holding, A. N. XL-MS: Protein cross-linking coupled with mass spectrometry. Methods. 89, 54-63 (2015).
- Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107, 3514-3543 (2007).
- Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing Protein Structure by Amino Acid-Specific Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28, 785-815 (2009).
- Limpikirati, P., Liu, T., Vachet, R. W. Covalent labeling-mass spectrometry with non-specific reagents for studying protein structure and interactions. Methods. 144, 79-93 (2018).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemistry Reviews. 120, 4335 (2020).
- Maleknia, S. D., Brenowitz, M., Chance, M. R. Millisecond radiolytic modification of peptides by synchrotron X-rays identified by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 71, 3965-3973 (1999).
- Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77, 5814-5822 (2005).
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 16, 2057-2063 (2005).
- Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Protein surface mapping using diethylpyrocarbonate with mass spectrometric detection. Analytical Chemistry. 80, 2895-2904 (2008).
- Mendoza, V. L., Antwi, K., Barón-rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structure of the Pre-amyloid Dimer of β-2-microglobulin from Covalent Labeling and Mass Spectrometry. Biochimica. 49, 1522-1532 (2010).
- Mendoza, V. L., Barón-Rodríguez, M. A., Blanco, C., Vachet, R. W. Structural insights into the pre-amyloid tetramer of β-2-microglobulin from covalent labeling and mass spectrometry. Biochimica. 50, 6711-6722 (2011).
- Zhou, Y., Vachet, R. W. Increased protein structural resolution from diethylpyrocarbonate-based covalent labeling and mass spectrometric detection. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 708-717 (2012).
- Borotto, N. B., et al. Investigating Therapeutic Protein Structure with Diethylpyrocarbonate Labeling and Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 87, 10627-10634 (2015).
- Liu, T., Marcinko, T. M., Kiefer, P. A., Vachet, R. W. Using Covalent Labeling and Mass Spectrometry To Study Protein Binding Sites of Amyloid Inhibiting Molecules. Analytical Chemistry. 89, 11583-11591 (2017).
- Limpikirati, P., et al. Covalent labeling and mass spectrometry reveal subtle higher order structural changes for antibody therapeutics. MAbs. 11, 463-476 (2019).
- Limpikirati, P., Pan, X., Vachet, R. W. Covalent Labeling with Diethylpyrocarbonate: Sensitive to the Residue Microenvironment, Providing Improved Analysis of Protein Higher Order Structure by Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 91, 8516-8523 (2019).
- Liu, T., Limpikirati, P., Vachet, R. W. Synergistic Structural Information from Covalent Labeling and Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry for Protein-Ligand Interactions. Analytical Chemistry. 91, 15248-15254 (2019).
- Pan, X., Limpikirati, P., Chen, H., Liu, T., Vachet, R. W. Higher-Order Structure Influences the Kinetics of Diethylpyrocarbonate Covalent Labeling of Proteins. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 658-665 (2020).
- Limpikirati, P. K., Zhao, B., Pan, X., Eyles, S. J., Vachet, R. W. Covalent Labeling/Mass Spectrometry of Monoclonal Antibodies with Diethylpyrocarbonate: Reaction Kinetics for Ensuring Protein Structural Integrity. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1223-1232 (2020).
- Liu, T., Marcinko, T. M., Vachet, R. W. Protein-Ligand Affinity Determinations Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 31, 1544-1553 (2020).
- Srikanth, R., Mendoza, V. L., Bridgewater, J. D., Zhang, G., Vachet, R. W. Copper Binding to β-2-Microglobulin and its Pre-Amyloid Oligomers. Biochimica. 48, 9871-9881 (2009).
- Lim, J., Vachet, R. W. Using mass spectrometry to study copper-protein binding under native and non-native conditions: β-2-microglobulin. Analytical Chemistry. 76, 3498-3504 (2004).
- Lindsley, C. W. Predictions and Statistics for the Best-Selling Drugs Globally and in the United States in 2018 and a Look Forward to 2024 Projections. ACS Chemical Neuroscience. 10, 1115 (2019).
- Floege, J., Ketteler, M. β2-Microglobulin-derived amyloidosis: An update. Kidney International. 59, 164 (2001).
- Antwi, K., et al. Cu (II) organizes β-2-microglobulin oligomers but is released upon amyloid formation. Protein Science. 17, 748-759 (2008).
- Dong, J., et al. Unique Effect of Cu(II) in the Metal-Induced Amyloid Formation of β-2-Microglobulin. Biochimica. 53, 1263-1274 (2014).
- Marcinko, T. M., Drews, T., Liu, T., Vachet, R. W. Epigallocatechin-3-gallate Inhibits Cu(II)-Induced β-2-Microglobulin Amyloid Formation by Binding to the Edge of Its β-Sheets. Biochimica. 59, 1093-1103 (2020).
- Zhou, Y., Vachet, R. W. Diethylpyrocarbonate Labeling for the Structural Analysis of Proteins: Label Scrambling in Solution and How to Avoid it. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 23, 899-907 (2012).
- Borotto, N. B., Degraan-Weber, N., Zhou, Y., Vachet, R. W. Label scrambling during CID of covalently labeled peptide ions. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 25, 1739-1746 (2014).
- Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical Chemistry. 90, 7721-7729 (2018).
- Schmidt, C., et al. Surface Accessibility and Dynamics of Macromolecular Assemblies Probed by Covalent Labeling Mass Spectrometry and Integrative Modeling. Analytical Chemistry. 89, 1459-1468 (2017).
- Zheng, X., Wintrode, P. L., Chance, M. R. Complementary Structural Mass Spectrometry Techniques Reveal Local Dynamics in Functionally Important Regions of a Metastable Serpin. Structure. 16, 38-51 (2008).
- Pan, Y., Piyadasa, H., O’Neil, J. D., Konermann, L. Conformational dynamics of a membrane transport protein probed by H/D exchange and covalent labeling: The glycerol facilitator. Journal of Molecular Biology. 416, 400-413 (2012).
- Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical Chemistry. 89, 2250-2258 (2017).
- Borotto, N. B., Zhang, Z., Dong, J., Burant, B., Vachet, R. W. Increased β-Sheet Dynamics and D-E Loop Repositioning Are Necessary for Cu(II)-Induced Amyloid Formation by β-2-Microglobulin. Biochimica. 56, 1095-1104 (2017).
- Shi, L., Liu, T., Gross, M. L., Huang, Y. Recognition of Human IgG1 by Fcγ Receptors: Structural Insights from Hydrogen-Deuterium Exchange and Fast Photochemical Oxidation of Proteins Coupled with Mass Spectrometry. Biochimica. 58, 1074-1080 (2019).
- Gerega, S. K., Downard, K. M. PROXIMO – A new docking algorithm to model protein complexes using data from radical probe mass spectrometry (RP-MS). Bioinformatics. 22, 1702-1709 (2006).
- Kamal, J. K. A., Chance, M. R. Modeling of protein binary complexes using structural mass spectrometry data. Protein Science. 17, 79-94 (2007).
