Marquage covalent avec diéthylpyrocarbonate pour l’étude de la structure d’ordre supérieur des protéines par spectrométrie de masse

Summary

Les procédures expérimentales pour effectuer un marquage covalent à base de diéthylpyrocarbonate avec détection spectrométrique de masse sont décrites. Le diéthylpyrocarbonate est simplement mélangé avec la protéine ou le complexe protéique d’intérêt, conduisant à la modification des résidus d’acides aminés accessibles aux solvants. Les résidus modifiés peuvent être identifiés après digestion protéolytique et analyse chromatographie liquide/spectrométrie de masse.

Abstract

La caractérisation de la structure d’ordre supérieur d’une protéine est essentielle pour comprendre sa fonction. La spectrométrie de masse (SEP) est apparue comme un outil puissant à cette fin, en particulier pour les systèmes protéiques difficiles à étudier par des méthodes traditionnelles. Pour étudier la structure d’une protéine par MS, des réactions chimiques spécifiques sont réalisées en solution qui codent l’information structurelle d’une protéine dans sa masse. Une approche particulièrement efficace consiste à utiliser des réactifs qui modifient de manière covalente les chaînes latérales d’acides aminés accessibles aux solvants. Ces réactions conduisent à des augmentations de masse qui peuvent être localisées avec une résolution au niveau des résidus lorsqu’elles sont combinées à la digestion protéolytique et à la spectrométrie de masse en tandem. Ici, nous décrivons les protocoles associés à l’utilisation du diéthylpyrocarbonate (DEPC) comme réactif de étiquetage covalent avec la détection de milliseconde. Le DEPC est une molécule hautement électrophile capable de étiqueter jusqu’à 30% des résidus dans la protéine moyenne, offrant ainsi une excellente résolution structurelle. Le DEPC a été utilisé avec succès avec ms pour obtenir des informations structurelles pour de petites protéines à domaine unique, telles que la β2-microglobuline, aux grandes protéines multi-domaines, telles que les anticorps monoclonaux.

Introduction

Les protéines sont des biomolécules essentielles dans pratiquement tous les processus physiologiques. La variété des fonctions que les protéines remplissent est possible en raison des structures qu’elles adoptent et des interactions qu’elles ont avec d’autres biomolécules. Pour comprendre la fonction des protéines à un niveau plus profond, des outils biochimiques et biophysiques sont nécessaires pour élucider ces caractéristiques et interactions structurelles importantes. Traditionnellement, la cristallographie aux rayons X, la microscopie électronique cryogénique et la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) ont fourni le détail de niveau atomique souhaité pour révéler la structure des protéines. Cependant, de nombreux systèmes protéiques ne peuvent pas être interrogés par ces techniques en raison d’un comportement de cristallisation médiocre, d’une disponibilité limitée des protéines, d’une hétérogénéité excessive des échantillons ou de limitations de poids moléculaire. Par conséquent, de nouvelles méthodes d’analyse ont vu le jour pour surmonter ces limites. Parmi les techniques émergentes qui peuvent fournir des informations structurelles sur les protéines, il y a la spectrométrie de masse.

La spectrométrie de masse (MS) mesure le rapport masse/charge (m/z) d’une molécule, de sorte que les informations structurelles d’ordre supérieur des protéines doivent être obtenues en codant les informations structurelles souhaitées dans la masse de la protéine. Plusieurs approches pour coder ces informations ont été développées, notamment l’échange hydrogène-deutérium (HDX)^1,2,3,4,la réticulation chimique (XL)^5,6,et le étiquetage covalent (CL)^7,8,9,10. Dans HDX, les hydrogènes d’amide de base sont échangés par des deutériums légèrement plus massifs à des vitesses qui dépendent de l’accessibilité des solvants et de l’étendue de la liaison H. L’étendue de HDX peut être localisée en digérant rapidement la protéine en fragments peptidiques avant de séparer et de mesurer ces fragments par le spectromètre de masse ou en dissociant la protéine dans une expérience descendante. La détermination du taux de change fournit un aperçu supplémentaire de la dynamique des protéines. HDX s’est avéré être un outil précieux pour caractériser la structure des protéines malgré les défis associés à l’échange de dos et le besoin d’équipement spécialisé pour maximiser la reproductibilité. Dans XL-MS, les protéines réagissent avec des réactifs bi-fonctionnels qui lient de manière covalent les chaînes latérales de résidus adjacentes au sein d’une protéine donnée ou entre deux protéines. Ce faisant, XL-MS peut fournir des contraintes de distance qui peuvent être utilisées pour caractériser la structure des protéines. Les régions de la protéine qui sont réticulées peuvent être identifiées par digestion protéolytique suivie d’une analyse par chromatographie liquide (LC)-MS. Bien que XL-MS soit un outil polyvalent qui a été utilisé pour étudier une variété de complexes protéiques, y compris les cellules internes, l’identification des produits XL est difficile et nécessite un logiciel spécialisé.

La CL-MS est apparue récemment comme un outil complémentaire et parfois alternatif basé sur la SEP pour étudier la structure et les interactions des protéines. Dans la CL-MS, une protéine ou un complexe protéique est modifié de manière covalente avec un réactif mono-fonctionnel qui peut réagir avec des chaînes latérales exposées au solvant (Figure 1). En comparant les degrés de modification d’une protéine ou d’un complexe protéique dans différentes conditions, des changements de conformation, des sites de liaison et des interfaces protéine-protéine peuvent être révélés. Après la réaction CL, des informations spécifiques au site, souvent au niveau d’un seul acide aminé, peuvent être obtenues à l’aide de flux de travail protéomiques ascendants typiques dans lesquels les protéines sont digérées protéolytiquement, les fragments peptidiques sont séparés par LC et les sites modifiés sont identifiés à l’aide de la SP en tandem (MS / MS). La riche histoire de la chimie bioconjuguée a rendu de nombreux réactifs disponibles pour les expériences cl-ms. Les réactifs cl se répartissent en deux grandes catégories: (i) spécifique et (ii) non spécifique. Des réactifs spécifiques réagissent avec un seul groupe fonctionnel (p. ex. amines libres)^8,10 et sont faciles à mettre en œuvre, mais ils ont tendance à fournir des informations structurelles limitées. Les réactifs non spécifiques réagissent avec une large gamme de chaînes latérales, mais nécessitent souvent des équipements spécialisés tels que des lasers ou des sources synchrotron pour produire ces espèces hautement réactives. Les radicaux hydroxyles sont le réactif non spécifique le plus couramment utilisé, ayant été appliqué dans les expériences d’empreintes de radicaux hydroxyles (HRF)^7,11,12,13 pour étudier un large éventail de protéines et de complexes protéiques dans diverses conditions.

Notre groupe de recherche a utilisé avec succès un autre réactif relativement non spécifique appelé diéthylpyrocarbonate (DEPC) pour étudier la structure et les interactions des protéines dans le contexte des expériences CL-MS^{14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.} DEPC offre la simplicité de réactifs d’étiquetage spécifiques (c’est-à-dire qu’aucun équipement spécialisé n’est nécessaire pour effectuer les réactions), tout en réagissant avec jusqu’à 30% d’acides aminés dans la protéine moyenne. En tant que réactif hautement électrophile, DEPC est capable de réagir avec le N-terminus et les chaînes latérales nucléophiles de la cystéine, de l’histidine, de la lysine, de la tyrosine, de la sérine et des résidus de thréonine. Typiquement, un seul produit de ces réactions est généré, ce qui entraîne une augmentation de masse de 72,02 Da. Ce type unique de produit contraste avec les jusqu’à 55 produits différents qui peuvent être produits lorsque les protéines réagissent avec les radicaux hydroxyles⁷. Une telle chimie simple facilite l’identification des sites étiquetés.

Ici, nous fournissons des protocoles pour l’utilisation de CL-MS à base de DEPC pour étudier la structure et les interactions des protéines. Les détails associés à la préparation des réactifs, aux réactions des protéines DEPC, aux conditions de digestion des protéines, aux paramètres LC-MS et MS/MS, ainsi qu’à l’analyse des données sont décrits. Nous démontrons également l’utilité du étiquetage DEPC en fournissant des exemples de résultats d’interactions protéine-métal, protéine-ligand et protéine-protéine ainsi que de protéines subissant des changements structurels lors du chauffage.

Protocol

1. Préparation de protéines et de réactifs Remarque : ce protocole inclut un exemple de flux de travail pour le étiquetage d’une protéine avec DEPC. Certaines conditions et concentrations de réactifs énumérées peuvent varier en fonction de la protéine de choix. Préparer toutes les solutions réactives dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL. Préparer une solution protéique de la concentration désirée, habituellement de l’ordre de dizaines de μM, …

Representative Results

Identification des sites de modification de DEPC et des pourcentages de modificationL’addition de masse due au marquage covalent peut être mesurée aux niveaux (a) de protéines intactes et (b) depeptides 8,9. Au niveau intact, une distribution d’espèces protéiques avec différents nombres d’étiquettes peut être obtenue à partir d’une analyse directe ou de LC-MS d’échantillons de protéines marqués. Pour obtenir des renseignements s…

Discussion

Étapes critiques
Plusieurs points concernant la conception expérimentale devraient être pris en compte pour assurer des résultats d’étiquetage fiables. Tout d’abord, pour maximiser l’étiquetage des protéines, il est nécessaire d’éviter les tampons avec des groupes fortement nucléophiles (par exemple, Tris) car ils peuvent réagir avec le DEPC et réduire l’étendue de l’étiquetage. Il est également concevable que de tels tampons puissent réagir avec des résidus étiquetés, entraîna…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	3448
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid	Millipore Sigma	M1254
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid sodium salt	Millipore Sigma	M9381
Acclaim PepMap RSLC C18 Column	Thermo Scientific	164537	300 μm x 15 cm, C18, 2 μm, 100 A
Acetonitrile	Fisher Scientific	A998-1
Diethylpyrocarbonate	Millipore Sigma	D5758
HPLC-grade water	Fisher Scientific	W5-1
Imidazole	Millipore Sigma	I5513
Immobilized chymotrypsin	ProteoChem	g4105
Immobilized trypsin, TPCK Treated	Thermo Fisher Scientific	20230
Iodoacetamide	Millipore Sigma	I1149
Tris(2-carboxyethyl)phosphine	Millipore Sigma	C4706