التجميع السريع للبنى متعددة الجينات باستخدام استنساخ البوابة الذهبية المعيارية
Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو توفير دليل مفصل خطوة بخطوة لتجميع البنى متعددة الجينات باستخدام نظام الاستنساخ المعياري القائم على استنساخ البوابة الذهبية. كما يقدم توصيات بشأن الخطوات الحاسمة لضمان التجميع الأمثل استنادا إلى خبراتنا.
Abstract
تمكن طريقة استنساخ البوابة الذهبية من التجميع السريع لجينات متعددة في أي ترتيب يحدده المستخدم. ويستخدم نوع IIS تقييد الإنزيمات التي تقطع خارج مواقع الاعتراف بها وخلق تراكم قصيرة. يستخدم نظام الاستنساخ المعياري هذا (MoClo) سير عمل هرمي يتم فيه استنساخ أجزاء الحمض النووي المختلفة ، مثل المروجين وتسلسلات الترميز (CDS) والمنهيين ، لأول مرة في متجه إدخال. ناقلات دخول متعددة ثم تجميع في وحدات النسخ. ثم تتصل عدة وحدات نسخ ببللازميد متعدد الجينات. استراتيجية الاستنساخ البوابة الذهبية هي ميزة هائلة لأنها تسمح ندبة أقل، والاتجاه، والتجمع وحدات في رد فعل وعاء واحد. ويمكن سير العمل الهرمي عادة من الاستنساخ السهل لمجموعة كبيرة ومتنوعة من البنى المتعددة الجينات دون الحاجة إلى التسلسل خارج ناقلات الدخول. يتيح استخدام التسرب من البروتين الفلوري الفحص البصري السهل. يوفر هذا العمل بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لتجميع البلازميدات متعددة الجينات باستخدام مجموعة الاستنساخ المعياري للخمائر (MoClo). نعرض النتائج المثلى ودون المستوى الأمثل لتجميع البلازميد متعدد الجينات ونقدم دليلا لفحص المستعمرات. وتنطبق استراتيجية الاستنساخ هذه إلى حد كبير على هندسة التمثيل الغذائي للخمائر وغيرها من الحالات التي يلزم فيها استنساخ البلازميد المتعدد الجينات.
Introduction
تهدف البيولوجيا التركيبية إلى هندسة النظم البيولوجية مع وظائف جديدة مفيدة للصناعات الصيدلانية والزراعية والكيميائية. تجميع أعداد كبيرة من شظايا الحمض النووي بطريقة عالية الإنتاجية هو تقنية أساسية في البيولوجيا الاصطناعية. مثل هذه العملية المعقدة يمكن أن تنهار إلى مستويات متعددة مع انخفاض التعقيد ، وهو مفهوم مستعار من العلوم الهندسية الأساسية1،2. في البيولوجيا التركيبية، عادة ما تتجمع شظايا الحمض النووي بشكل هرمي استنادا إلى الوظيفة: ‘1’ مستوى الجزء: تشير “الأجزاء” إلى شظايا الحمض النووي ذات وظيفة محددة، مثل المروج، وتسلسل الترميز، والمنهي، وأصل النسخ المتماثل؛ و’2′ العوامل التي يمكن أن تكون ذات طبيعة مختلفة. ‘2’ مستوى وحدات النسخ: تتكون الوحدة من مروج وتسلسل ترميز ومنهي قادر على نسخ جين واحد؛ ‘3’ المستوى المتعدد الجينات: يحتوي البلازميد المتعدد الجينات على عدة وحدات ثلاثية المستويات تتألف في كثير من الأحيان من مسار استقلابي كامل. هذا التجمع الهرمي رائدة من قبل المجتمع BioBrick هو المفهوم التأسيسي لتجميع مجموعات كبيرة من DNAs في البيولوجيا الاصطناعية3.
في العقد الماضي4،5،6،7، وقد سهلت تقنية استنساخ البوابة الذهبية بشكل كبير تجميع الحمض النووي الهرمي2. كما تم تطوير العديد من أساليب الاستنساخ متعددة الجزأة الأخرى ، مثل استنساخ جيبسون8، الاستنساخ المستقل عن الربط (SLIC)9، والاستنساخ القائم على الختان (USER)10، ورد فعل الدراجات ليغان (LCR)11، وفي إعادة دمج الجسم الحي (DNA Assembler)12،13، حتى الآن. ولكن استنساخ البوابة الذهبية هو طريقة مثالية لتجميع الحمض النووي لأنه مستقل عن التسلسلات الخاصة بالجينات ، مما يسمح بتجميع ندبة واتجاهية ووحدات في رد فعل وعاء واحد. يستفيد استنساخ البوابة الذهبية من إنزيمات تقييد IIS من النوع التي تتعرف على تسلسل غير باليندروميك لإنشاء تراكمات متداخلة خارج موقع التعرف2. ثم ينضم الليغاز إلى شظايا الحمض النووي الملدن للحصول على تجميع متعدد الأجزاء. وقد مكن تطبيق استراتيجية الاستنساخ هذه على نظام الاستنساخ المعياري (MoClo) من تجميع ما يصل إلى 10 شظايا الحمض النووي مع أكثر من 90٪ من المحولات التي تم فحصها والتي تحتوي على البناء المجمع بشكل صحيح4.
يوفر نظام MoClo مزايا هائلة عجلت بدورة التصميم والبناء والاختبار للبيولوجيا التركيبية. أولا، تمكن الأجزاء القابلة للتبديل الاستنساخ الجمعي من اختبار مساحة كبيرة من المعلمات بسرعة. على سبيل المثال، يتطلب تحسين المسار الأيضي عادة ركوب الدراجات من خلال العديد من المروجين لكل جين لتحقيق التوازن بين تدفق المسار. يمكن لنظام MoClo التعامل بسهولة مع مهام الاستنساخ المطلوبة. ثانيا، يحتاج المرء إلى تسلسل الجزء البلازميد ولكن عادة ليس TU أو البلازميدات متعددة الجينات. في معظم الحالات، الفحص عن طريق PCR مستعمرة أو تقييد الهضم كافية للتحقق على مستوى TU ومتعددة الجينات البلازميد. وذلك لأن استنساخ جزء البلازميد هو الخطوة الوحيدة التي تتطلب PCR، الذي يدخل في كثير من الأحيان الطفرات. ثالثا، نظام موكلو مثالي لبناء مسارات التمثيل الغذائي المعقدة متعددة الجينات. وأخيرا، بسبب التراكمات العالمية، يمكن إعادة استخدام الجزء البلازميدات ومشاركتها مع مجتمع الهندسة الحيوية بأكمله. حاليا، مجموعات موكلو متوفرة للنباتات14،15،5،16،17، الفطريات6،18،19،20،21،22، البكتيريا7،23،24،25،26،27، والحيوانات28،29. كما تم تقديم منصة MoClo متعددة المملكة مؤخرا30.
لSaccharomyces cerevisiae, وقد وضعت لي وآخرون6 مجموعة أدوات موكلو تنوعا, مورد ممتاز للمجتمع البيولوجيا الاصطناعية الخميرة. تأتي هذه المجموعة في شكل مريح من 96 بئرا وتحدد ثمانية أنواع من أجزاء الحمض النووي القابلة للتبديل مع مجموعة متنوعة من المروجين المميزين ، والبروتينات الفلورية ، والمنهيين ، وعلامات الببتيد ، وعلامات الاختيار ، وأصل النسخ المتماثل ، وأدوات تحرير الجينوم. تسمح مجموعة الأدوات هذه بتجميع ما يصل إلى خمس وحدات نسخ في بلازميد متعدد الجينات. هذه الميزات هي قيمة لهندسة التمثيل الغذائي الخميرة، التي يتم التعبير عن مسارات جزئية أو كاملة لإنتاج المواد الكيميائية المستهدفة. باستخدام هذه المجموعة، وقد الأمثل الباحثين إنتاج geraniol، linalool31،البنسلين32،حمض موكونيك33،النيلي34،وبيتالين35 في الخميرة.
هنا نقدم مفصلة، خطوة بخطوة بروتوكول لتوجيه استخدام مجموعة أدوات موكلو لتوليد مسارات متعددة الجينات للتعبير إما الظهارية أو الجينومية. من خلال الاستخدام المكثف لهذه المجموعة ، وجدنا أن القياس الدقيق لتركيزات الحمض النووي هو المفتاح لضمان توزيع الاعتدال لكل جزء في رد فعل البوابة الذهبية. ونحن نوصي أيضا ليغان الحمض النووي T4 على ليغاس الحمض النووي T7 لأن الأول يعمل بشكل أفضل مع أعداد أكبر من يتدلى36. وأخيرا، يجب إزالة أي مواقع اعتراف داخلية من BsmBI و BsaI أو تدجينها قبل التجميع. بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن ينظر في تجميع أجزاء لإزالة مواقع داخلية متعددة وتحقيق الأمثل codon في وقت واحد. نحن نظهر كيفية استخدام مجموعة الأدوات هذه من خلال التعبير عن مسار من خمسة جينات لإنتاج β كاروتين والليكوبين في S. cerevisiae. نعرض كذلك كيفية ضرب موقع ADE2 باستخدام أدوات تحرير الجينوم من هذه المجموعة. تم اختيار هذه التجارب القائمة على الألوان لسهولة التصور. كما أننا نبين كيفية توليد بروتينات الاندماج وخلق طفرات الأحماض الأمينية باستخدام استنساخ البوابة الذهبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر مجموعة الاستنساخ القائمة على MoClo التي طورها Lee et al. موردا ممتازا للتجميع السريع لوحدات النسخ من واحد إلى خمسة في بلازميد متعدد الجينات إما للتكرار أو الاندماج في جينوم الخميرة. استخدام هذه المجموعة يلغي اختناق الاستنساخ المستهلكة للوقت التي توجد في كثير من الأحيان للتعبير عن جينات مت?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة البحوث لجامعة ولاية نيويورك (الجائزة رقم: 71272) وجائزة IMPACT للجامعة في بافالو (الجائزة رقم: 000077).
Materials
| 0.5 mm Glass beads | RPI research products | 9831 | For lysing yeast cells |
| Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Component of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Bacto Peptone | BD& Company | 211677 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| BsaI-HFv2 | New England Biolabs | R3733S | a highly efficient version of BsaI restriction enzyme |
| Carbenicillin | Fisher Bioreagents | 4800-94-6 | Antibiotic for screening at the transcription unit level |
| Chloramphenicol | Fisher Bioreagents | 56-75-7 | Antibiotic for screening at the entry vector level |
| CSM-His | Sunrise Sciences | 1006-010 | Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD & Company | 291940 | Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| dNTP mix | Promega | U1515 | dNTPs for PCR |
| Esp3I | New England Biolabs | R0734S | a highly efficient isoschizomer of BsmBI |
| Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit | Zymo Research | T2001 | For yeast transformation |
| Hexanes | Fisher Chemical | H302-1 | For carotenoid extraction from yeast cells |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | 25389-94-0 | Antibiotic for screening at the multigene plasmid level |
| LB Agar, Miller | Fisher Bioreagents | BP1425-2 | Lysogenic agar medium for E. coli culturing |
| LB Broth, Miller | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
| Lycopene | Cayman chemicals | NC1142173 | For lycopene quantification |
| MoClo YTK | Addgene | 1000000061 | Depositing Lab: John Deuber |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England Biolabs | T1010L | For plasmid purification from E.coli |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000c | For measuring accurate DNA concentrations |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189S | Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization |
| Nourseothricin Sulphate | Goldbio | N-500-100 | Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study |
| Phusion HF reaction Buffer (5X) | New England Biolabs | B0518S | Buffer for PCR using Phusion polymerase |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | High fidelity polymerase for all the PCR reactions |
| pLM494 | Addgene | 100539 | Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study |
| Quartz Cuvette | Thermo Electron | 10050801 | For quantifing carotenoids |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | Ligase for Golden Gate cloning |
| Thermocycler | BIO-RAD | 1851148 | For performing all the PCR and cloning reactions |
| Tissue Homogenizer | Bullet Blender | Model: BBX24 | For homogenization of yeast cells |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Genesys 150 | For quantifing carotenoids |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | BP1422-500 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| β-carotene | Alfa Aesar | AAH6010603 | For β-carotene quantification |
Riferimenti
- Endy, D. Foundations for engineering biology. Nature. 438 (7067), 449-453 (2005).
- Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), 5553 (2009).
- Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. Journal of Biological Engineering. 2, 5 (2008).
- Peccoud, J., et al. A Modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS ONE. 6 (2), (2011).
- Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid: an iterative cloning system for standardized assembly of reusable genetic modules. PLoS One. 6 (7), 21622 (2011).
- Lee, M. E., DeLoache, W. C., Cervantes, B., Dueber, J. E. A Highly characterized yeast toolkit for modular, multipart assembly. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 975-986 (2015).
- Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile Golden-Gate framework towards universal DNA assembly. PLoS One. 13 (1), 0189892 (2018).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Research. 35 (7), 55 (2007).
- de Kok, S., et al. Rapid and reliable DNA assembly via ligase cycling reaction. ACS Synthetic Biology. 3 (2), 97-106 (2014).
- Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Research. 37 (2), 16 (2009).
- Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
- Gantner, J., et al. Peripheral infrastructure vectors and an extended set of plant parts for the Modular Cloning system. PLoS One. 13 (5), 0197185 (2018).
- Ordon, J., et al. Generation of chromosomal deletions in dicotyledonous plants employing a user-friendly genome editing toolkit. Plant Journal. 89 (1), 155-168 (2017).
- Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid 2.0: a comprehensive DNA assembly framework for plant synthetic biology. Plant Physiology. 162 (3), 1618-1631 (2013).
- Agmon, N., et al. Yeast Golden Gate (yGG) for the efficient assembly of S. cerevisiae transcription units. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 853-859 (2015).
- Hernanz-Koers, M., et al. FungalBraid: A GoldenBraid-based modular cloning platform for the assembly and exchange of DNA elements tailored to fungal synthetic biology. Fungal Genetics and Biology. 116, 51-61 (2018).
- Prielhofer, R., et al. GoldenPiCS: a Golden Gate-derived modular cloning system for applied synthetic biology in the yeast Pichia pastoris. BMC Systems Biology. 11 (1), 123 (2017).
- Celinska, E., et al. Gate Assembly system dedicated to complex pathway manipulation in Yarrowia lipolytica. Microbial Biotechnology. 10 (2), 450-455 (2017).
- Pullmann, P. K., et al. A modular two yeast species secretion system for the production and preparative application of fungal peroxygenases. bioRxiv. , (2020).
- Wu, D., Schandry, N., Lahaye, T. A modular toolbox for Golden-Gate-based plasmid assembly streamlines the generation of Ralstonia solanacearum species complex knockout strains and multi-cassette complementation constructs. Molecular Plant Pathology. 19 (6), 1511-1522 (2018).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo assembly standard and new E. coli part library enable rapid combinatorial design for synthetic and traditional biology. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 99-103 (2016).
- Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
- Leonard, S. P., et al. Genetic Engineering of bee gut microbiome acteria with a Ttoolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
- Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetica. 202 (4), 1277-1288 (2016).
- Martella, A., Matjusaitis, M., Auxillos, J., Pollard, S. M., Cai, Y. EMMA: An extensible mammalian modular assembly toolkit for the rapid design and production of diverse expression vectors. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1380-1392 (2017).
- Chiasson, D., et al. A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific Reports. 9 (1), 10131 (2019).
- Denby, C. M., et al. Industrial brewing yeast engineered for the production of primary flavor determinants in hopped beer. Nature Communications. 9 (1), 965 (2018).
- Awan, A. R., et al. Biosynthesis of the antibiotic nonribosomal peptide penicillin in baker’s yeast. Nature Communications. 8, 15202 (2017).
- Leavitt, J. M., et al. Biosensor-Enabled Directed evolution to improve muconic acid production in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Journal. 12 (10), (2017).
- Hsu, T. M., et al. Employing a biochemical protecting group for a sustainable indigo dyeing strategy. Nature Chemical Biology. 14 (3), 256-261 (2018).
- Grewal, P. S., Modavi, C., Russ, Z. N., Harris, N. C., Dueber, J. E. Bioproduction of a betalain color palette in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 45, 180-188 (2018).
- Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
- Vazquez-Vilar, M., et al. Software-assisted stacking of gene modules using GoldenBraid 2.0 DNA-assembly framework. Methods in Molecular Biology. 1284, 399-420 (2015).
- Pullmann, P., et al. Mutagenesis: An efficient multi-site-saturation mutagenesis approach by Golden Gate cloning with automated primer design. Scientific Reports. 9 (1), 10932 (2019).
- Engler, C., Sylvestre, M., Valla, S., Lale, R. . DNA Cloning and Assembly Methods. 1116, 119-131 (2014).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
- Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
- Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 51, 263-273 (1986).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (1), 171-174 (2019).
- Ryan, O. W., et al. Selection of chromosomal DNA libraries using a multiplex CRISPR system. Elife. 3, (2014).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Heintz, N., Gong, S. Small-scale preparations of yeast DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (10), (2020).
- Hochrein, L., Mitchell, L. A., Schulz, K., Messerschmidt, K., Mueller-Roeber, B. L-SCRaMbLE as a tool for light-controlled Cre-mediated recombination in yeast. Nature Communications. 9 (1), 1931 (2018).
- Verwaal, R., et al. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).
- Jones, E., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R., et al. . The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression. 11, 181 (1982).
- Sehgal, N., et al. CRISPR gene editing in yeast: an experimental protocol for an upper-division undergraduate laboratory course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (6), 592-601 (2018).
- Stepanenko, O. V., Stepanenko, O. V., Kuznetsova, I. M., Verkhusha, V. V., Turoverov, K. K. Sensitivity of superfolder GFP to ionic agents. PLoS One. 9 (10), 110750 (2014).
