모듈형 골든 게이트 복제를 사용하여 다중 유전자 구조물의 신속한 조립
Summary
이 프로토콜의 목표는 골든 게이트 복제를 기반으로 모듈형 복제 시스템을 사용하여 다중 유전자 구조를 조립하기위한 상세한 단계별 가이드를 제공하는 것입니다. 또한 우리의 경험을 바탕으로 최적의 어셈블리를 보장하기 위한 중요한 단계에 대한 권장 사항을 제공합니다.
Abstract
골든 게이트 복제 방법은 사용자 정의 배열에서 여러 유전자의 신속한 조립을 가능하게합니다. 그것은 그들의 인식 사이트 외부 잘라 하 고 짧은 오버행을 만드는 유형 IIS 제한 효소를 활용. 이 모듈식 복제(MoClo) 시스템은 프로모터, 코딩 서열(CDS) 및 종착기와 같은 다른 DNA 부품이 먼저 엔트리 벡터로 복제되는 계층적 워크플로우를 사용합니다. 그런 다음 여러 항목 벡터가 전사 단위로 어셈블합니다. 몇몇 전사 단위는 그 때 다중 유전자 플라스미드로 연결합니다. 골든 게이트 복제 전략은 한 냄비 반응에서 흉터가없고 방향성 및 모듈식 조립을 허용하기 때문에 엄청난 이점입니다. 계층적 워크플로우를 통해 전형적으로 엔트리 벡터를 넘어 시퀀싱할 필요 없이 다양한 다중 유전자 구조의 촉진 복제를 가능하게 합니다. 형광 단백질 중퇴를 사용하면 쉽게 시각적 으로 선별 할 수 있습니다. 이 작업은 효모 모듈식 복제(MoClo) 키트를 사용하여 다중 유전자 플라스미드를 조립하기 위한 상세한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 우리는 다중 유전자 플라스미드 조립의 최적 및 최적 결과를 보여주고 식민지에 대한 검열을위한 가이드를 제공합니다. 이 복제 전략은 효모 대사 공학 및 다중 유전자 플라스미드 복제가 필요한 다른 상황에 매우 적용 가능합니다.
Introduction
합성 생물학은 제약, 농업 및 화학 산업에 유용한 새로운 기능으로 생물학적 시스템을 설계하는 것을 목표로합니다. 높은 처리량 방식으로 많은 수의 DNA 단편을 조립하는 것은 합성 생물학의 기초 기술입니다. 이러한 복잡한 과정은 복잡성이 감소하여 여러 단계로 분해 될 수 있으며, 기본 공학과학1,2에서빌린 개념. 합성 생물학에서 DNA 단편은 일반적으로 기능에 기초하여 계층적으로 조립됩니다: (i) 부품 수준: “부품”은 프로모터, 코딩 서열, 터미네이터, 복제의 기원과 같은 특정 기능을 가진 DNA 단편을 지칭한다. (ii) 전사 단위 (TU) 수준: TU는 프로모터, 코딩 서열 및 단일 유전자를 전사할 수 있는 종점으로 구성된다. (iii) 다중 유전자 수준: 다중 유전자 플라스미드는 전체 대사 경로로 자주 구성된 다중 투구를 함유하고 있습니다. BioBrick 커뮤니티가 개척한 이 계층적 조립은 합성 생물학3에서대형 DN 세트의 조립을 위한 기본 개념입니다.
지난 10년 동안4,5,6,7,골든 게이트 복제 기술은 계층적 DNA 어셈블리2를현저히 촉진했다. 깁슨 복제8,결찰-독립 복제(SLIC)9,우라실 절제 기반 복제(USER)10,리구아 사이클링 반응(LCR)11,생체 내 재조합(DNA 어셈블러)12,13등 다른 다중 부품 복제 방법도 지금까지 개발되었다. 그러나 골든 게이트 복제는 유전자 특정 서열과 독립적이기 때문에 이상적인 DNA 조립 방법이므로 흉터가 없고 방향성 및 모듈식 조립을 한 냄비 반응에서 허용합니다. 골든 게이트 복제는 비 palindromic 서열을 인식하는 유형 IIS 제한 효소를 활용하여 인식 부위2외부에서 비틀거리는 오버행을 만듭니다. 그런 다음 리거제는 어닐링된 DNA 단편에 합류하여 다중 부분 조립을 얻습니다. 모듈형 복제(MoClo) 시스템에 이 복제 전략을 적용하면 올바르게 조립된 구조4를포함하는 90% 이상의 변압제를 통해 최대 10개의 DNA 단편을 조립할 수 있게 되었다.
MoClo 시스템은 합성 생물학의 설계 구축 테스트 주기를 가속화한 엄청난 이점을 제공합니다. 첫째, 교환 가능한 부품은 결합 복제를 가능하게 하여 큰 파라미터 공간을 빠르게 테스트할 수 있습니다. 예를 들면, 신진 대사 통로를 최적화하는 것은 일반적으로 통로 플럭스의 균형을 맞추기 위하여 각 유전자를 위한 많은 프로모터를 통해 순환을 요구합니다. MoClo 시스템은 이러한 까다로운 복제 작업을 쉽게 처리할 수 있습니다. 둘째, 하나는 부품 플라스미드를 서열화할 필요가 있지만 전형적으로TU 또는 다중 유전자 플라스미드가 아닙니다. 대부분의 경우, 콜로니 PCR 또는 제한 소화에 의한 스크리닝은 TU 및 다중 유전자 플라스미드 수준에서 검증하기에 충분하다. 이는 플라스미드 부분을 복제하는 것이 돌연변이를 자주 도입하는 PCR을 필요로 하는 유일한 단계이기 때문입니다. 셋째, MoClo 시스템은 다중 유전자 복합 대사 경로를 구축하는 데 이상적입니다. 마지막으로, 보편적 인 오버행으로 인해 부품 플라스미드를 재사용하고 전체 생물 공학 커뮤니티와 공유 할 수 있습니다. 현재, MoClo 키트는 식물14,15,5,16,17,곰팡이6,18,19,20,21,22,박테리아7,23,24,25,26,27및 동물28,29에사용할 수 있습니다. 멀티 킹덤 MoClo 플랫폼도 최근에 도입되었습니다30.
Saccharomyces cerevisiae를위해, Lee외. 6효모 합성 생물학 커뮤니티를 위한 우수한 자원인 다재다능한 MoClo 툴킷을 개발했습니다. 이 키트는 편리한 96웰 형식으로 제공되며 다양한 유형의 상호 교환 가능한 DNA 부품을 잘 특징적인 프로모터, 형광 단백질, 터미네이터, 펩타이드 태그, 선택 마커, 복제 원산지 및 게놈 편집 도구를 정의합니다. 이 툴킷은 최대 5개의 전사 단위를 다중 유전자 플라스미드로 조립할 수 있게 한다. 이러한 특징은 부분 또는 전체 경로가 표적 화학 물질을 생산하기 위해 과도하게 표현되는 효모 신진 대사 공학에 유용합니다. 이 키트를 사용하여 연구자들은 제라니올, 리날로올31,페니실린32,무코닉산33,인디고34,베타레인35 의 효모 의 생산을 최적화했다.
여기서 우리는 상피 또는 게놈 발현을 위한 다중 유전자 통로를 생성하기 위하여 MoClo 툴킷의 사용을 안내하는 상세한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 이 키트의 광범위한 사용을 통해, 우리는 DNA 농도의 정확한 측정이 골든 게이트 반응에서 각 부분의 동등성 분포를 보장하는 열쇠임을 발견했다. 우리는 또한 T7 DNA 리개세 위에 T4 DNA 리구아제추천36의 더큰 숫자와 더 잘 작동하기 때문에. 마지막으로, BsmBI 및 BsaI의 내부 인식 사이트는 조립 전에 제거하거나 길들여야 합니다. 또는 여러 내부 사이트를 제거하고 동시 코돈 최적화를 달성하기 위해 부품을 합성하는 것을 고려할 수 있습니다. 우리는 S. cerevisiae에 있는 β 카로틴 및 리코펜 생산을 위한 5 유전자 통로를 표현하여 이 공구키트를 사용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 또한이 키트에서 게놈 편집 도구를 사용하여 ADE2 궤적을 노크하는 방법을 보여줍니다. 이러한 색상 기반 실험은 쉽게 시각화할 수 있는 선택되었습니다. 우리는 또한 융합 단백질을 생성하고 골든 게이트 복제를 사용하여 아미노산 돌연변이를 만드는 방법을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lee et al.에 의해 개발된 MoClo 기반 복제 키트는 효모 게놈내로의 복제 또는 통합을 위해 1~5개의 전사 단위를 다중 유전자 플라스미드로 빠르게 조립할 수 있는 우수한 자원을 제공한다. 이 키트의 사용은 효모에서 여러 유전자를 표현하기 위해 자주 존재하는 시간이 많이 소요되는 복제 병목 현상을 제거합니다.
우리는 T4 DNA 리구아제와 골든 게이트 복제의 소화 / 결찰 주기에 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 뉴욕 주립 대학의 연구 재단 (상 #: 71272)과 버팔로 대학의 영향 상 (상 #: 000077)에 의해 지원되었다.
Materials
| 0.5 mm Glass beads | RPI research products | 9831 | For lysing yeast cells |
| Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Component of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Bacto Peptone | BD& Company | 211677 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| BsaI-HFv2 | New England Biolabs | R3733S | a highly efficient version of BsaI restriction enzyme |
| Carbenicillin | Fisher Bioreagents | 4800-94-6 | Antibiotic for screening at the transcription unit level |
| Chloramphenicol | Fisher Bioreagents | 56-75-7 | Antibiotic for screening at the entry vector level |
| CSM-His | Sunrise Sciences | 1006-010 | Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD & Company | 291940 | Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| dNTP mix | Promega | U1515 | dNTPs for PCR |
| Esp3I | New England Biolabs | R0734S | a highly efficient isoschizomer of BsmBI |
| Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit | Zymo Research | T2001 | For yeast transformation |
| Hexanes | Fisher Chemical | H302-1 | For carotenoid extraction from yeast cells |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | 25389-94-0 | Antibiotic for screening at the multigene plasmid level |
| LB Agar, Miller | Fisher Bioreagents | BP1425-2 | Lysogenic agar medium for E. coli culturing |
| LB Broth, Miller | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
| Lycopene | Cayman chemicals | NC1142173 | For lycopene quantification |
| MoClo YTK | Addgene | 1000000061 | Depositing Lab: John Deuber |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England Biolabs | T1010L | For plasmid purification from E.coli |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000c | For measuring accurate DNA concentrations |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189S | Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization |
| Nourseothricin Sulphate | Goldbio | N-500-100 | Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study |
| Phusion HF reaction Buffer (5X) | New England Biolabs | B0518S | Buffer for PCR using Phusion polymerase |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | High fidelity polymerase for all the PCR reactions |
| pLM494 | Addgene | 100539 | Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study |
| Quartz Cuvette | Thermo Electron | 10050801 | For quantifing carotenoids |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | Ligase for Golden Gate cloning |
| Thermocycler | BIO-RAD | 1851148 | For performing all the PCR and cloning reactions |
| Tissue Homogenizer | Bullet Blender | Model: BBX24 | For homogenization of yeast cells |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Genesys 150 | For quantifing carotenoids |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | BP1422-500 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| β-carotene | Alfa Aesar | AAH6010603 | For β-carotene quantification |
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