Быстрая сборка многофункциональных конструкций с использованием модульного клонирования Золотых Ворот

Summary

Целью этого протокола является предоставление подробного, пошагового руководства по сборке много генных конструкций с использованием модульной системы клонирования на основе клонирования Золотых Ворот. Он также дает рекомендации по важнейшим шагам для обеспечения оптимальной сборки на основе нашего опыта.

Abstract

Метод клонирования Золотых Ворот обеспечивает быструю сборку нескольких генов в любом пользовательском механизме. Он использует ферменты ограничения IIS типа, которые вырезают за пределами их сайтов распознавания и создают короткий свес. Эта модульная система клонирования (MoClo) использует иерархический рабочий процесс, в котором различные части ДНК, такие как промоутеры, последовательности кодирования (CDS) и терминаторы, сначала клонируются в вектор входа. Затем несколько векторов входа собираются в единицы транскрипции. Затем несколько единиц транскрипции соединяются с много генной плазмидой. Стратегия клонирования Золотых Ворот имеет огромное преимущество, поскольку позволяет без шрамов, направленной и модульной сборке в одной реакции. Иерархический рабочий процесс обычно позволяет легко клонировать большое разнообразие много генных конструкций без необходимости секвенирования за пределами векторов входа. Использование флуоресцентных белковых отсева обеспечивает легкий визуальный скрининг. Эта работа обеспечивает подробный, шаг за шагом протокол для сборки много генных плазмидов с использованием дрожжевой модульного клонирования (MoClo) комплект. Мы показываем оптимальные и неоптимальные результаты много генной плазмидной сборки и предоставляем руководство по скринингу для колоний. Эта стратегия клонирования в значительной степени применима для инженерии метаболизма дрожжей и других ситуаций, в которых требуется много генная плазмидная клонирование.

Introduction

Синтетическая биология направлена на создание биологических систем с новыми функциональными возможностями, полезными для фармацевтической, сельскохозяйственной и химической промышленности. Сборка большого количества фрагментов ДНК с высокой пропускной способностью является основополагающим методом в синтетической биологии. Такой сложный процесс может разбиться на несколько уровней с уменьшением сложности, концепция заимствована из фундаментальных инженерных^{наук 1,2}. В синтетической биологии фрагменты ДНК обычно собираются иерархически на основе функциональности: i) уровень части: “части” относятся к фрагментам ДНК с определенной функцией, такой как промоутер, последовательность кодирования, терминатор, происхождение репликации; ii) уровень транскрипционных единиц (ТУ): ТУ состоит из промоутера, последовательности кодирования и терминатора, способного транскрибировать один ген; iii) Много генный уровень: много генная плазмида содержит несколько ТУ, часто состоящих из всего метаболического пути. Эта иерархическая сборка, впервые разработанная сообществом BioBrick, является основополагающим понятием для сборки больших наборов ДНК в синтетической биологии^3.

В последнее десятилетие^4,5,6,7, Золотые Ворота клонирования техника значительно облегчила иерархической сборки^{ДНК 2}. Многие другие многочастные методы клонирования, такие как Гибсон^{клонирования 8}, лигация независимого^{клонирования}(SLIC) 9 , uracil иссечение основе клонирования (USER)¹⁰, лигазы велосипедной реакции (LCR)¹¹, и виво рекомбинации^(ДНКсборщик) 12^,13, также были разработаны до сих пор. Но клонирование Золотых Ворот является идеальным методом сборки ДНК, потому что он не зависит от генно-специфических последовательностей, что позволяет без шрамов, направленной и модульной сборки в реакции одного горшка. Клонирование Золотых Ворот использует ферменты ограничения типа IIS, которые распознают не палиндромную последовательность для создания ступенчатых свесов за пределами сайта^{распознавания 2.} Затем лигаза присоединяется к анналированным фрагментам ДНК, чтобы получить многочастивую сборку. Применение этой стратегии клонирования к модульной системе клонирования (MoClo) позволило собрать до 10 фрагментов ДНК с более чем 90% трансформантами, экранированными, содержащими правильно собранную^{конструкцию 4.}

Система MoClo предлагает огромные преимущества, которые ускорили цикл проектирования-сборки-теста синтетической биологии. Во-первых, сменные части позволяют комбинатору быстро тестировать большое пространство параметров. Например, оптимизация метаболического пути обычно требует езды на велосипеде через множество промоутеров для каждого гена, чтобы сбалансировать поток пути. Система MoClo может легко справиться с такими сложными задачами клонирования. Во-вторых, нужно секвенировать часть плазмидной, но, как правило, не ТУ или много генных плазмидов. В большинстве случаев скрининг по колониям ПЦР или пищеварения ограничения достаточен для проверки на уровне ТУ и много генной плазмиды. Это потому, что клонирование плазмиды части является единственным шагом, требующим ПЦР, который часто вводит мутации. В-третьих, система MoClo идеально подходит для построения много генных сложных метаболических путей. Наконец, из-за универсальных свесов, часть плазмиды могут быть повторно использованы и совместно со всем сообществом биоинженерии. В настоящее время комплекты MoClo^{доступны для растений 14,15,5,16,17,}грибов^{6,18,19,20,21,22,бактерий 7,23,24,25,26,27,}и^{животных 28,29.} Многосемейная платформа MoClo также была введена недавно³⁰.

Для Saccharomyces cerevisiae, Ли и др.⁶ разработали универсальный инструментарий MoClo, отличный ресурс для дрожжей синтетической биологии сообщества. Этот комплект поставляется в удобном формате 96-колодец и определяет восемь типов сменных частей ДНК с разнообразной коллекцией хорошо охарактеризованных промоутеров, флуоресцентных белков, терминаторов, пептидных тегов, маркеров отбора, происхождения репликации и инструментов редактирования генома. Этот набор инструментов позволяет сборку до пяти единиц транскрипции в много генную плазмиду. Эти особенности являются ценными для дрожжей метаболической инженерии, в которой частичные или целые пути чрезмерно выражены для производства целевых химических веществ. Используя этот комплект, исследователи оптимизировали производство гераниола, линалула^31,пенициллина^{32, слизистойкислоты 33, индиго34}и беталена^{35 в} дрожжах.

Здесь мы предоставляем подробный, шаг за шагом протокол для руководства использованием инструментария MoClo для создания многогенных путей для эписомальной или геномной экспрессии. Благодаря обширному использованию этого комплекта, мы обнаружили, что точное измерение концентраций ДНК является ключом к обеспечению равномерного распределения каждой части в реакции Золотых Ворот. Мы также рекомендуем T4 ДНК лигазы над T7 ДНК лигазы, потому что первый работает лучше с большим количеством свесов³⁶. Наконец, любые сайты внутреннего распознавания BsmBI и BsaI должны быть удалены или одомашнены до сборки. Кроме того, можно рассмотреть вопрос об синтезе частей для удаления нескольких внутренних сайтов и для достижения одновременной оптимизации кодона. Мы демонстрируем, как использовать этот инструментарий, выражая пятигенный путь для производства β-каротина и ликопина в S. cerevisiae. Мы также показываем, как выбить локус ADE2 с помощью инструментов для редактирования генома из этого комплекта. Эти цветовые эксперименты были выбраны для легкой визуализации. Мы также демонстрируем, как генерировать синтез белков и создавать аминокислотные мутации с помощью клонирования Золотых Ворот.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол иерархического клонирования, предлагаемый в этом наборе инструментов, можно разделить на три основных этапа: 1. Плазмиды части клонирования; 2. единицы транскрипции клонирования (TUs); 3. Клонирование много генных плазмидов(рисунок 1). Этот протокол нач?…

Representative Results

Здесь результаты четырех репликационные многогенные плазмиды для β (желтый) и ликопин (красный) производства. Была построена одна интегративная многогенерная плазмида для нарушения локуса ADE2, колонии которой красные. Клониро…

Discussion

Комплект клонирования на основе MoClo, разработанный Lee et al., обеспечивает отличный ресурс для быстрой сборки от одного до пяти единиц транскрипции в много генную плазмиду либо для репликации, либо для интеграции в геном дрожжей. Использование этого комплекта устраняет трудоемкое узкое м?…

Materials

0.5 mm Glass beads	RPI research products	9831	For lysing yeast cells
Bacto Agar	BD & Company	214010	Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Bacto Peptone	BD& Company	211677	Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
BsaI-HFv2	New England Biolabs	R3733S	a highly efficient version of BsaI restriction enzyme
Carbenicillin	Fisher Bioreagents	4800-94-6	Antibiotic for screening at the transcription unit level
Chloramphenicol	Fisher Bioreagents	56-75-7	Antibiotic for screening at the entry vector level
CSM-His	Sunrise Sciences	1006-010	Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Dextrose	Fisher Chemical	D16-500	Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	BD & Company	291940	Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
dNTP mix	Promega	U1515	dNTPs for PCR
Esp3I	New England Biolabs	R0734S	a highly efficient isoschizomer of BsmBI
Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit	Zymo Research	T2001	For yeast transformation
Hexanes	Fisher Chemical	H302-1	For carotenoid extraction from yeast cells
Kanamycin	Fisher Bioreagents	25389-94-0	Antibiotic for screening at the multigene plasmid level
LB Agar, Miller	Fisher Bioreagents	BP1425-2	Lysogenic agar medium for E. coli culturing
LB Broth, Miller	Fisher Bioreagents	BP1426-2	Lysogenic liquid medium for E. coli culturing
Lycopene	Cayman chemicals	NC1142173	For lycopene quantification
MoClo YTK	Addgene	1000000061	Depositing Lab: John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep Kit	New England Biolabs	T1010L	For plasmid purification from E.coli
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000c	For measuring accurate DNA concentrations
NotI-HF	New England Biolabs	R3189S	Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization
Nourseothricin Sulphate	Goldbio	N-500-100	Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study
Phusion HF reaction Buffer (5X)	New England Biolabs	B0518S	Buffer for PCR using Phusion polymerase
Phusion High Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S	High fidelity polymerase for all the PCR reactions
pLM494	Addgene	100539	Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study
Quartz Cuvette	Thermo Electron	10050801	For quantifing carotenoids
T4 ligase	New England Biolabs	M0202S	Ligase for Golden Gate cloning
Thermocycler	BIO-RAD	1851148	For performing all the PCR and cloning reactions
Tissue Homogenizer	Bullet Blender	Model: BBX24	For homogenization of yeast cells
UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	Genesys 150	For quantifing carotenoids
Yeast Extract	Fisher Bioreagents	BP1422-500	Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
β-carotene	Alfa Aesar	AAH6010603	For β-carotene quantification