Montaje rápido de construcciones multigénicas mediante clonación modular Golden Gate
Summary
El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía detallada paso a paso para el montaje de construcciones multigénicos utilizando el sistema de clonación modular basado en la clonación Golden Gate. También ofrece recomendaciones sobre pasos críticos para garantizar un montaje óptimo basado en nuestras experiencias.
Abstract
El método de clonación Golden Gate permite el montaje rápido de múltiples genes en cualquier disposición definida por el usuario. Utiliza enzimas de restricción de tipo IIS que cortan fuera de sus sitios de reconocimiento y crean un voladizo corto. Este sistema modular de clonación (MoClo) utiliza un flujo de trabajo jerárquico en el que diferentes partes del ADN, como promotores, secuencias de codificación (CDS) y terminadores, se clonan primero en un vector de entrada. A continuación, se ensamblan varios vectores de entrada en unidades de transcripción. Varias unidades de transcripción se conectan a un plásmido multigénico. La estrategia de clonación golden gate es de enorme ventaja porque permite un montaje sin cicatrices, direccional y modular en una reacción de una olla. El flujo de trabajo jerárquico normalmente permite la clonación fácil de una gran variedad de construcciones multigénicas sin necesidad de secuenciar más allá de los vectores de entrada. El uso de deserción de proteínas fluorescentes permite una fácil detección visual. Este trabajo proporciona un protocolo detallado paso a paso para el montaje de plásmidos multigéneros utilizando el kit de clonación modular de levadura (MoClo). Mostramos resultados óptimos y subóptimos del ensamblaje plásmido multigéneo y proporcionamos una guía para la detección de colonias. Esta estrategia de clonación es altamente aplicable para la ingeniería metabólica de levaduras y otras situaciones en las que se requiere clonación de plásmidos multi genes.
Introduction
La biología sintética tiene como objetivo diseñar sistemas biológicos con nuevas funcionalidades útiles para las industrias farmacéutica, agrícola y química. Ensamblar un gran número de fragmentos de ADN de una manera de alto rendimiento es una tecnología fundamental en biología sintética. Un proceso tan complicado puede dividirse en múltiples niveles con una complejidad decreciente, un concepto tomado de las ciencias básicas de la ingeniería1,2. En biología sintética, los fragmentos de ADN suelen ensamblarse jerárquicamente en función de la funcionalidad: (i) Nivel de pieza: “partes” se refiere a fragmentos de ADN con una función específica, como un promotor, una secuencia de codificación, un terminador, un origen de replicación; (ii) Nivel de unidades de transcripción (TU): un TU consiste en un promotor, una secuencia de codificación y un terminador capaz de transcribir un solo gen; (iii) Nivel multigénico: un plásmido multigénico contiene múltiples TUs que con frecuencia se componen de una vía metabólica completa. Este montaje jerárquico pionero por la comunidad BioBrick es el concepto fundamental para el montaje de grandes conjuntos de DNAs en biología sintética3.
En la última década4,5,6,7, la técnica de clonación Golden Gate ha facilitado significativamente el montaje jerárquico de ADN2. Muchos otros métodos de clonación de varias partes, como la clonación gibson8,clonación independiente de ligadura (SLIC)9,clonación basada en la escisión de uracil (USUARIO)10,la reacción de ciclismo de ligasa (LCR)11,y la recombinación in vivo (ensamblador de ADN)12,13,también se han desarrollado hasta ahora. Pero la clonación de Golden Gate es un método de ensamblaje de ADN ideal porque es independiente de secuencias específicas de genes, lo que permite un montaje sin cicatrices, direccional y modular en una reacción de una sola olla. La clonación golden gate aprovecha las enzimas de restricción de tipo IIS que reconocen una secuencia no palindrómica para crear voladizos escalonados fuera del sitio de reconocimiento2. A continuación, un ligase se une a los fragmentos de ADN recocido para obtener un ensamblaje de varias partes. La aplicación de esta estrategia de clonación al sistema de clonación modular (MoClo) ha permitido el montaje de hasta 10 fragmentos de ADN con más del 90% de transformadores proyectados que contienen la construcción correctamente montada4.
El sistema MoClo ofrece enormes ventajas que han acelerado el ciclo de diseño-construcción-prueba de biología sintética. En primer lugar, las piezas intercambiables permiten la clonación combinatoria para probar rápidamente un gran espacio de parámetros. Por ejemplo, la optimización de una vía metabólica generalmente requiere recorrer en bicicleta muchos promotores de cada gen para equilibrar el flujo de la vía. El sistema MoClo puede manejar fácilmente tareas de clonación tan exigentes. En segundo lugar, es necesario secuenciar la parte plásmida, pero normalmente no la TU o los plásmidos multigénicos. En la mayoría de los casos, el cribado por PCR de colonia o la digestión de restricción es suficiente para la verificación a nivel de TU y plásmido multigénico. Esto se debe a que la clonación del plásmido de la pieza es el único paso que requiere PCR, que con frecuencia introduce mutaciones. En tercer lugar, el sistema MoClo es ideal para construir vías metabólicas complejas multigénero. Por último, debido a los voladizos universales, los plásmidos de la parte se pueden reutilizar y compartir con toda la comunidad de bioingeniería. Actualmente, los kits MoClo están disponibles para plantas14,15,5,16,17,hongos6,18,19,20,21,22,bacterias7,23,24,25,26,27y animales28,29. Recientemente también se ha introducido una plataforma MoClo de variosreinos.
Para Saccharomyces cerevisiae,Lee et al.6 han desarrollado un versátil kit de herramientas MoClo, un excelente recurso para la comunidad de biología sintética de levadura. Este kit viene en un formato conveniente de 96 pozos y define ocho tipos de piezas de ADN intercambiables con una colección diversa de promotores bien caracterizados, proteínas fluorescentes, terminadores, etiquetas de péptido, marcadores de selección, origen de replicación y herramientas de edición del genoma. Este kit de herramientas permite el montaje de hasta cinco unidades de transcripción en un plásmido multigénico. Estas características son valiosas para la ingeniería metabólica de levadura, en la que las vías parciales o enteras se expresan en exceso para producir productos químicos dirigidos. Con este kit, los investigadores han optimizado la producción de geraniol, linalool31,penicilina32,ácido muconico33,índigo34y betalain35 en levadura.
Aquí proporcionamos un protocolo detallado paso a paso para guiar el uso del kit de herramientas MoClo para generar vías multigénero para la expresión episomal o genómica. A través del uso extensivo de este kit, hemos encontrado que la medición precisa de las concentraciones de ADN es clave para garantizar la distribución equimolar de cada parte en la reacción de Golden Gate. También recomendamos el ligase de ADN T4 sobre el ligase de ADN T7 porque el primero funciona mejor con un mayor número de voladizos36. Por último, cualquier sitio de reconocimiento interno de BsmBI y BsaI debe ser eliminado o domesticado antes del montaje. Alternativamente, uno puede considerar sintetizar piezas para eliminar varios sitios internos y lograr la optimización simultánea del codón. Demostramos cómo utilizar este kit de herramientas expresando una vía de cinco genes para la producción de β caroteno y licopeno en S. cerevisiae. Además, mostramos cómo noquear el locus ADE2 usando las herramientas de edición del genoma de este kit. Estos experimentos basados en colores fueron seleccionados para facilitar la visualización. También demostramos cómo generar proteínas de fusión y crear mutaciones de aminoácidos usando la clonación golden gate.
Protocol
Representative Results
Discussion
El kit de clonación basado en MoClo desarrollado por Lee et al. proporciona un excelente recurso para el montaje rápido de una a cinco unidades de transcripción en un plásmido multigéneros, ya sea para replicación o integración en el genoma de la levadura. El uso de este kit elimina el cuello de botella de clonación que consume mucho tiempo y que con frecuencia existe para expresar múltiples genes en levadura.
Probamos cinco condiciones diferentes para los ciclos de digestión/ligadur…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Research Foundation para la Universidad Estatal de Nueva York (Premio #: 71272) y el Premio IMPACT de la Universidad en Buffalo (Premio #: 000077).
Materials
| 0.5 mm Glass beads | RPI research products | 9831 | For lysing yeast cells |
| Bacto Agar | BD & Company | 214010 | Component of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Bacto Peptone | BD& Company | 211677 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| BsaI-HFv2 | New England Biolabs | R3733S | a highly efficient version of BsaI restriction enzyme |
| Carbenicillin | Fisher Bioreagents | 4800-94-6 | Antibiotic for screening at the transcription unit level |
| Chloramphenicol | Fisher Bioreagents | 56-75-7 | Antibiotic for screening at the entry vector level |
| CSM-His | Sunrise Sciences | 1006-010 | Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids | BD & Company | 291940 | Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM) |
| dNTP mix | Promega | U1515 | dNTPs for PCR |
| Esp3I | New England Biolabs | R0734S | a highly efficient isoschizomer of BsmBI |
| Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit | Zymo Research | T2001 | For yeast transformation |
| Hexanes | Fisher Chemical | H302-1 | For carotenoid extraction from yeast cells |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | 25389-94-0 | Antibiotic for screening at the multigene plasmid level |
| LB Agar, Miller | Fisher Bioreagents | BP1425-2 | Lysogenic agar medium for E. coli culturing |
| LB Broth, Miller | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | Lysogenic liquid medium for E. coli culturing |
| Lycopene | Cayman chemicals | NC1142173 | For lycopene quantification |
| MoClo YTK | Addgene | 1000000061 | Depositing Lab: John Deuber |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England Biolabs | T1010L | For plasmid purification from E.coli |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000c | For measuring accurate DNA concentrations |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189S | Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization |
| Nourseothricin Sulphate | Goldbio | N-500-100 | Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study |
| Phusion HF reaction Buffer (5X) | New England Biolabs | B0518S | Buffer for PCR using Phusion polymerase |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | High fidelity polymerase for all the PCR reactions |
| pLM494 | Addgene | 100539 | Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study |
| Quartz Cuvette | Thermo Electron | 10050801 | For quantifing carotenoids |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | Ligase for Golden Gate cloning |
| Thermocycler | BIO-RAD | 1851148 | For performing all the PCR and cloning reactions |
| Tissue Homogenizer | Bullet Blender | Model: BBX24 | For homogenization of yeast cells |
| UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Scientific | Genesys 150 | For quantifing carotenoids |
| Yeast Extract | Fisher Bioreagents | BP1422-500 | Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD) |
| β-carotene | Alfa Aesar | AAH6010603 | For β-carotene quantification |
Riferimenti
- Endy, D. Foundations for engineering biology. Nature. 438 (7067), 449-453 (2005).
- Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), 5553 (2009).
- Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. Journal of Biological Engineering. 2, 5 (2008).
- Peccoud, J., et al. A Modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS ONE. 6 (2), (2011).
- Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid: an iterative cloning system for standardized assembly of reusable genetic modules. PLoS One. 6 (7), 21622 (2011).
- Lee, M. E., DeLoache, W. C., Cervantes, B., Dueber, J. E. A Highly characterized yeast toolkit for modular, multipart assembly. ACS Synthetic Biology. 4 (9), 975-986 (2015).
- Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile Golden-Gate framework towards universal DNA assembly. PLoS One. 13 (1), 0189892 (2018).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products. Nucleic Acids Research. 35 (7), 55 (2007).
- de Kok, S., et al. Rapid and reliable DNA assembly via ligase cycling reaction. ACS Synthetic Biology. 3 (2), 97-106 (2014).
- Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways. Nucleic Acids Research. 37 (2), 16 (2009).
- Gibson, D. G. Synthesis of DNA fragments in yeast by one-step assembly of overlapping oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 37 (20), 6984-6990 (2009).
- Engler, C., et al. A golden gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
- Gantner, J., et al. Peripheral infrastructure vectors and an extended set of plant parts for the Modular Cloning system. PLoS One. 13 (5), 0197185 (2018).
- Ordon, J., et al. Generation of chromosomal deletions in dicotyledonous plants employing a user-friendly genome editing toolkit. Plant Journal. 89 (1), 155-168 (2017).
- Sarrion-Perdigones, A., et al. GoldenBraid 2.0: a comprehensive DNA assembly framework for plant synthetic biology. Plant Physiology. 162 (3), 1618-1631 (2013).
- Agmon, N., et al. Yeast Golden Gate (yGG) for the efficient assembly of S. cerevisiae transcription units. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 853-859 (2015).
- Hernanz-Koers, M., et al. FungalBraid: A GoldenBraid-based modular cloning platform for the assembly and exchange of DNA elements tailored to fungal synthetic biology. Fungal Genetics and Biology. 116, 51-61 (2018).
- Prielhofer, R., et al. GoldenPiCS: a Golden Gate-derived modular cloning system for applied synthetic biology in the yeast Pichia pastoris. BMC Systems Biology. 11 (1), 123 (2017).
- Celinska, E., et al. Gate Assembly system dedicated to complex pathway manipulation in Yarrowia lipolytica. Microbial Biotechnology. 10 (2), 450-455 (2017).
- Pullmann, P. K., et al. A modular two yeast species secretion system for the production and preparative application of fungal peroxygenases. bioRxiv. , (2020).
- Wu, D., Schandry, N., Lahaye, T. A modular toolbox for Golden-Gate-based plasmid assembly streamlines the generation of Ralstonia solanacearum species complex knockout strains and multi-cassette complementation constructs. Molecular Plant Pathology. 19 (6), 1511-1522 (2018).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo assembly standard and new E. coli part library enable rapid combinatorial design for synthetic and traditional biology. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 99-103 (2016).
- Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
- Leonard, S. P., et al. Genetic Engineering of bee gut microbiome acteria with a Ttoolkit for modular assembly of broad-host-range plasmids. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1279-1290 (2018).
- Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetica. 202 (4), 1277-1288 (2016).
- Martella, A., Matjusaitis, M., Auxillos, J., Pollard, S. M., Cai, Y. EMMA: An extensible mammalian modular assembly toolkit for the rapid design and production of diverse expression vectors. ACS Synthetic Biology. 6 (7), 1380-1392 (2017).
- Chiasson, D., et al. A unified multi-kingdom Golden Gate cloning platform. Scientific Reports. 9 (1), 10131 (2019).
- Denby, C. M., et al. Industrial brewing yeast engineered for the production of primary flavor determinants in hopped beer. Nature Communications. 9 (1), 965 (2018).
- Awan, A. R., et al. Biosynthesis of the antibiotic nonribosomal peptide penicillin in baker’s yeast. Nature Communications. 8, 15202 (2017).
- Leavitt, J. M., et al. Biosensor-Enabled Directed evolution to improve muconic acid production in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology Journal. 12 (10), (2017).
- Hsu, T. M., et al. Employing a biochemical protecting group for a sustainable indigo dyeing strategy. Nature Chemical Biology. 14 (3), 256-261 (2018).
- Grewal, P. S., Modavi, C., Russ, Z. N., Harris, N. C., Dueber, J. E. Bioproduction of a betalain color palette in Saccharomyces cerevisiae. Metabolic Engineering. 45, 180-188 (2018).
- Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
- Vazquez-Vilar, M., et al. Software-assisted stacking of gene modules using GoldenBraid 2.0 DNA-assembly framework. Methods in Molecular Biology. 1284, 399-420 (2015).
- Pullmann, P., et al. Mutagenesis: An efficient multi-site-saturation mutagenesis approach by Golden Gate cloning with automated primer design. Scientific Reports. 9 (1), 10932 (2019).
- Engler, C., Sylvestre, M., Valla, S., Lale, R. . DNA Cloning and Assembly Methods. 1116, 119-131 (2014).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
- Chen, X., Zaro, J. L., Shen, W. C. Fusion protein linkers: property, design and functionality. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (10), 1357-1369 (2013).
- Mullis, K., et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 51, 263-273 (1986).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. 31 (7), 1120-1123 (2015).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (1), 171-174 (2019).
- Ryan, O. W., et al. Selection of chromosomal DNA libraries using a multiplex CRISPR system. Elife. 3, (2014).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Heintz, N., Gong, S. Small-scale preparations of yeast DNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2020 (10), (2020).
- Hochrein, L., Mitchell, L. A., Schulz, K., Messerschmidt, K., Mueller-Roeber, B. L-SCRaMbLE as a tool for light-controlled Cre-mediated recombination in yeast. Nature Communications. 9 (1), 1931 (2018).
- Verwaal, R., et al. High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous. Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).
- Jones, E., Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R., et al. . The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression. 11, 181 (1982).
- Sehgal, N., et al. CRISPR gene editing in yeast: an experimental protocol for an upper-division undergraduate laboratory course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (6), 592-601 (2018).
- Stepanenko, O. V., Stepanenko, O. V., Kuznetsova, I. M., Verkhusha, V. V., Turoverov, K. K. Sensitivity of superfolder GFP to ionic agents. PLoS One. 9 (10), 110750 (2014).
