Snabb montering av multigenkonstruktioner med modulär Golden Gate-kloning

Summary

Målet med detta protokoll är att tillhandahålla en detaljerad steg-för-steg-guide för montering av multigenkonstruktioner med hjälp av det modulära kloningssystemet baserat på Golden Gate-kloning. Det ger också rekommendationer om kritiska steg för att säkerställa optimal montering baserat på våra erfarenheter.

Abstract

Golden Gate-kloningsmetoden möjliggör snabb montering av flera gener i alla användardefinierade arrangemang. Den använder typ IIS-begränsningsenzymer som skär utanför deras igenkänningsplatser och skapar ett kort överhäng. Detta modulära kloningssystem (MoClo) använder ett hierarkiskt arbetsflöde där olika DNA-delar, till exempel promotors, kodningssekvenser (CDS) och terminatorer, först klonas till en ingångsvektor. Flera postvektorer monteras sedan i transkriptionsenheter. Flera transkriptionsenheter ansluts sedan till en multigenplasmid. Golden Gate-kloningsstrategin är av enorm fördel eftersom den tillåter ärrlös, riktad och modulär montering i en enpottreaktion. Det hierarkiska arbetsflödet möjliggör vanligtvis enkel kloning av ett stort antal multigenkonstruktioner utan behov av sekvensering utöver ingångsvektorer. Användningen av fluorescerande proteinavhopp möjliggör enkel visuell screening. Detta arbete ger ett detaljerat, steg-för-steg-protokoll för montering av multigenplasmider med hjälp av moclo-kit (Yeast Modular Cloning). Vi visar optimala och suboptimala resultat av multigenplasmidmontering och ger en guide för screening för kolonier. Denna kloningsstrategi är mycket tillämplig för jästmetabolisk teknik och andra situationer där multigenplasmidkloning krävs.

Introduction

Syntetisk biologi syftar till att konstruera biologiska system med nya funktioner som är användbara för läkemedels-, jordbruks- och kemiindustrin. Att montera ett stort antal DNA-fragment på ett höggenomströmningssätt är en grundläggande teknik inom syntetisk biologi. En sådan komplicerad process kan bryta ner i flera nivåer med minskande komplexitet, ett koncept lånat från grundläggande ingenjörsvetenskaper^1,2. Inom syntetisk biologi monterar DNA-fragment vanligtvis hierarkiskt baserat på funktionalitet: i) Delnivå: “delar” avser DNA-fragment med en specifik funktion, såsom en promotor, en kodningssekvens, en terminator, ett ursprung för replikering; ii) Tu-nivå (Transcription units) : en TU består av en promotor, en kodningssekvens och en terminator som kan transkribera en enda gen. iii) Multigennivå: En multigenplasmid innehåller flera TUs som ofta består av en hel metabolisk väg. Denna hierarkiska församling som är pionjär av BioBrick-samhället är det grundläggande konceptet för montering av stora uppsättningar DNA i syntetisk^{biologi 3}.

Under det senaste decenniet^{har 4,5,6,7}, Golden Gate kloningstekniken avsevärt underlättat hierarkisk DNA-montering². Många andra flerdelad kloningsmetoder, såsom Gibson kloning^8,ligaturoberoende kloning (SLIC)^9,uracil excision-baserad kloning (USER)¹⁰, ligase cykelreaktion (LCR)¹¹, och in vivo rekombination (DNA Assembler)^12,13, har också utvecklats hittills. Men Golden Gate-kloning är en idealisk DNA-monteringsmetod eftersom den är oberoende av genspecifika sekvenser, vilket möjliggör ärrfri, riktad och modulär montering i en enpottreaktion. Golden Gate kloning drar nytta av typ IIS begränsning enzymer som känner igen en icke-palindromisk sekvens för att skapa förskjutna överhäng utanför igenkännings platsen². En ligase förenar sedan de glödgade DNA-fragmenten för att få en flerdelad sammansättning. Genom att tillämpa denna kloningsstrategi på moclo-systemet (modulär kloning) har monteringen av upp till 10 DNA-fragment med över 90 % transformatorer avskärmade som innehåller den korrekt monterade^{konstruktionen 4}.

MoClo-systemet erbjuder enorma fördelar som har påskyndat design-build-testcykeln för syntetisk biologi. För det första möjliggör de utbytbara delarna kombinatorisk kloning för att snabbt testa ett stort antal parametrar. Till exempel kräver optimering av en metabolisk väg vanligtvis cykling genom många promotors för varje gen för att balansera vägflödet. MoClo-systemet kan enkelt hantera sådana krävande kloningsuppgifter. För det andra måste man sekvensera delen plasmid men vanligtvis inte TU eller multigenplasmider. I de flesta fall är screening genom koloni PCR eller begränsningssammanfattning tillräcklig för verifiering på TU- och multigenplasmidnivå. Detta beror på att kloning av delen plasmid är det enda steget som kräver PCR, som ofta introducerar mutationer. För det tredje är MoClo-systemet idealiskt för att bygga komplexa metaboliska vägar med flera gener. Slutligen, på grund av de universella överhängen, kan de delplasmider återanvändas och delas med hela bioengineeringsgemenskapen. För närvarande finns MoClo-kit tillgängliga för växter^{14,15,5,16,17,svampar 6,18,19,20,21,22,bakterier 7,23,24,25,26,27}och djur^28,29. En MoClo-plattform med flera kungarike har också introducerats nyligen³⁰.

För Saccharomyces cerevisiaehar Lee et al.⁶ utvecklat en mångsidig MoClo-verktygslåda, en utmärkt resurs för jästsyntetisk biologigemenskap. Detta kit finns i ett bekvämt 96-brunnsformat och definierar åtta typer av utbytbara DNA-delar med en mångfaldig samling av väl karakteriserade promotors, fluorescerande proteiner, terminatorer, peptidtaggar, urvalsmarkörer, replikerings ursprung och genomredigeringsverktyg. Denna verktygslåda gör det möjligt att montera upp till fem transkriptionsenheter i en multigenplasmid. Dessa egenskaper är värdefulla för jästmetabolisk teknik, där partiella eller hela vägar är överp uttryckta för att producera riktade kemikalier. Med hjälp av detta kit har forskare optimerat produktionen av geraniol, linalool³¹, penicillin³², mukonsyra³³, indigo³⁴, och betalain³⁵ i jäst.

Här tillhandahåller vi ett detaljerat, steg-för-steg-protokoll för att vägleda användningen av MoClo-verktygslådan för att generera flergenvägar för antingen episomal eller genomiskt uttryck. Genom omfattande användning av detta kit har vi funnit att noggrann mätning av DNA-koncentrationer är nyckeln till att säkerställa equimolarfördelningen av varje del i Golden Gate-reaktionen. Vi rekommenderar också T4 DNA ligase över T7 DNA ligase eftersom den förra fungerar bättre med större antal överhäng³⁶. Slutligen måste alla interna igenkänningsplatser för BsmBI och BsaI avlägsnas eller tämjas före monteringen. Alternativt kan man överväga att syntetisera delar för att ta bort flera interna webbplatser och för att uppnå samtidig kodonoptimering. Vi visar hur man använder denna verktygslåda genom att uttrycka en fem-gen väg för β-karoten och lykopen produktion i S. cerevisiae. Vi visar vidare hur man slår ut ADE2-locusen med hjälp av genomredigeringsverktygen från detta kit. Dessa färgbaserade experiment valdes för enkel visualisering. Vi visar också hur man genererar fusionsproteiner och skapar aminosyramutationer med Golden Gate-kloning.

Protocol

OBS: Det hierarkiska kloningsprotokollet som erbjuds i denna verktygslåda kan delas in i tre huvudsteg: 1. Kloningsdelplasmider; 2. Avskriftsenheter för kloning(TUs). 3. Kloning av multigenplasmider (figur 1). Detta protokoll börjar från primer design och slutar med tillämpningar av klonade multi-gene plasmid. 1. Primer design för kloning delen plasmid (pYTK001): Designa de främre och omvända primers som innehåller flankerande nukleotider TTT i …

Representative Results

Här resultaten av fyra replikatoriska multi-gen plasmider för β-karoten (gul) och lykopen (röd) produktion. En integrativ multi-gene plasmid för att störa ADE2 locus konstruerades, vars kolonier är röda. Klonings-CDS till ingångsvektorn (pYTK001)ERG20 förstärktes från jästgenomet och de tre karotenoidgenerna crtE, crtYB, crtI från plasmid pLM494<sup …

Discussion

MoClo-baserade kloningssatsen som utvecklats av Lee et al. ger en utmärkt resurs för snabb montering av en till fem transkriptionsenheter i en multigenplasmid antingen för replikering eller integration i jästgenomet. Användningen av detta kit eliminerar den tidskrävande kloningsflaskhalsen som ofta finns för att uttrycka flera gener i jäst.

Vi testade fem olika förhållanden för matsmältnings-/ligaturcyklerna av Golden Gate-kloning med T4 DNA-ligas. Vi fann att 30 cykler av matsmäl…

Materials

0.5 mm Glass beads	RPI research products	9831	For lysing yeast cells
Bacto Agar	BD & Company	214010	Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Bacto Peptone	BD& Company	211677	Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
BsaI-HFv2	New England Biolabs	R3733S	a highly efficient version of BsaI restriction enzyme
Carbenicillin	Fisher Bioreagents	4800-94-6	Antibiotic for screening at the transcription unit level
Chloramphenicol	Fisher Bioreagents	56-75-7	Antibiotic for screening at the entry vector level
CSM-His	Sunrise Sciences	1006-010	Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Dextrose	Fisher Chemical	D16-500	Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	BD & Company	291940	Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
dNTP mix	Promega	U1515	dNTPs for PCR
Esp3I	New England Biolabs	R0734S	a highly efficient isoschizomer of BsmBI
Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit	Zymo Research	T2001	For yeast transformation
Hexanes	Fisher Chemical	H302-1	For carotenoid extraction from yeast cells
Kanamycin	Fisher Bioreagents	25389-94-0	Antibiotic for screening at the multigene plasmid level
LB Agar, Miller	Fisher Bioreagents	BP1425-2	Lysogenic agar medium for E. coli culturing
LB Broth, Miller	Fisher Bioreagents	BP1426-2	Lysogenic liquid medium for E. coli culturing
Lycopene	Cayman chemicals	NC1142173	For lycopene quantification
MoClo YTK	Addgene	1000000061	Depositing Lab: John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep Kit	New England Biolabs	T1010L	For plasmid purification from E.coli
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000c	For measuring accurate DNA concentrations
NotI-HF	New England Biolabs	R3189S	Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization
Nourseothricin Sulphate	Goldbio	N-500-100	Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study
Phusion HF reaction Buffer (5X)	New England Biolabs	B0518S	Buffer for PCR using Phusion polymerase
Phusion High Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S	High fidelity polymerase for all the PCR reactions
pLM494	Addgene	100539	Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study
Quartz Cuvette	Thermo Electron	10050801	For quantifing carotenoids
T4 ligase	New England Biolabs	M0202S	Ligase for Golden Gate cloning
Thermocycler	BIO-RAD	1851148	For performing all the PCR and cloning reactions
Tissue Homogenizer	Bullet Blender	Model: BBX24	For homogenization of yeast cells
UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	Genesys 150	For quantifing carotenoids
Yeast Extract	Fisher Bioreagents	BP1422-500	Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
β-carotene	Alfa Aesar	AAH6010603	For β-carotene quantification