Rask montering av multigenkonstruksjoner ved hjelp av modulær golden gate-kloning

Summary

Målet med denne protokollen er å gi en detaljert, trinnvis guide for montering av multigenkonstruksjoner ved hjelp av det modulære kloningssystemet basert på Golden Gate-kloning. Det gir også anbefalinger om kritiske skritt for å sikre optimal montering basert på våre erfaringer.

Abstract

Golden Gate-kloningsmetoden muliggjør rask montering av flere gener i ethvert brukerdefinert arrangement. Den bruker type IIS-begrensningsenzymer som kutter utenfor deres anerkjennelsessteder og skaper et kort overheng. Dette modulære kloningssystemet (MoClo) bruker en hierarkisk arbeidsflyt der forskjellige DNA-deler, for eksempel promotorer, kodesekvenser (CDS) og terminatorer, først klones inn i en inngangsvektor. Flere inngangsvektorer samles deretter i transkripsjonsenheter. Flere transkripsjonsenheter kobles deretter til en multigenplasmid. Golden Gate-kloningsstrategien er av enorm fordel fordi den tillater arrfri, retningsmessig og modulær montering i en en-pott-reaksjon. Den hierarkiske arbeidsflyten muliggjør vanligvis facile-kloning av et stort utvalg av flergenkonstruksjoner uten behov for sekvensering utover inngangsvektorer. Bruken av fluorescerende proteinfrafall muliggjør enkel visuell screening. Dette arbeidet gir en detaljert, trinnvis protokoll for montering av multigenplasmider ved hjelp av gjær modulær kloning (MoClo) kit. Vi viser optimale og suboptimale resultater av multi-gen plasmid montering og gir en guide for screening for kolonier. Denne kloning strategien er svært anvendelig for gjær metabolsk engineering og andre situasjoner der multi-gen plasmid kloning er nødvendig.

Introduction

Syntetisk biologi har som mål å konstruere biologiske systemer med nye funksjoner som er nyttige for farmasøytisk, landbruks- og kjemisk industri. Montering av et stort antall DNA-fragmenter på en høy gjennomstrømningsmåte er en grunnleggende teknologi i syntetisk biologi. En slik komplisert prosess kan brytes ned i flere nivåer med synkende kompleksitet, et konsept lånt fra grunnleggende ingeniørvitenskap^1,2. I syntetisk biologi samler DNA-fragmenter vanligvis hierarkisk basert på funksjonalitet: (i) Delnivå: “deler” refererer til DNA-fragmenter med en bestemt funksjon, for eksempel en promotor, en kodingssekvens, en terminator, en opprinnelse av replikering; (ii) Transkripsjonsenheter (TU) nivå: en TU består av en promotor, en kodingssekvens og en terminator som er i stand til å transkribere et enkelt gen; (iii) Multigennivå: en multigenplasmid inneholder flere TUer som ofte består av en hel metabolsk vei. Denne hierarkiske samlingen som er banebrytende av BioBrick-samfunnet er det grunnleggende konseptet for montering av store sett med DNAer i syntetisk biologi³.

I løpet av det siste tiåret^4,5,6,7, golden gate kloning teknikken har betydelig tilrettelagt hierarkisk DNA-montering². Mange andre flerdelte kloningsmetoder, for eksempel Gibson kloning⁸, ligation-uavhengig kloning (SLIC)⁹, uracil excision-basert kloning (USER)¹⁰, ligase sykkelreaksjonen (LCR)¹¹, og in vivo rekombinasjon (DNA Assembler)^12,13, er også utviklet så langt. Men Golden Gate kloning er en ideell DNA-monteringsmetode fordi den er uavhengig av genspesifikke sekvenser, noe som tillater arrfri, retningsbestemt og modulær montering i en en-pot reaksjon. Golden Gate-kloning drar nytte av type IIS-begrensningsenzymer som gjenkjenner en ikke-palindrom sekvens for å skape forskjøvede overheng utenfor anerkjennelsesstedet². En ligase blir deretter med de glødede DNA-fragmentene for å få en flerdelt montering. Ved å bruke denne kloningsstrategien på det modulære kloningssystemet (MoClo) har det mulig å montere opptil 10 DNA-fragmenter med over 90% transformanter screenet som inneholder den riktig monterte konstruksjonen⁴.

MoClo-systemet tilbyr enorme fordeler som har akselerert design-build-test-syklusen til syntetisk biologi. For det første muliggjør de utskiftbare delene kombinatorisk kloning for å teste et stort rom med parametere raskt. For eksempel krever optimalisering av en metabolsk vei vanligvis å sykle gjennom mange promotører for hvert gen for å balansere banestrømmen. MoClo-systemet kan enkelt håndtere slike krevende kloningsoppgaver. For det andre må man sekvensere delen plasmid, men vanligvis ikke TU eller multi-genplasmider. I de fleste tilfeller er screening av koloni PCR eller begrensning fordøyelse tilstrekkelig for verifisering på TU og multi-gen plasmid nivå. Dette er fordi kloning av delen plasmid er det eneste trinnet som krever PCR, som ofte introduserer mutasjoner. For det tredje er MoClo-systemet ideelt for å bygge multigenkomplekse metabolske veier. Til slutt, på grunn av de universelle overhengene, kan delen plasmider gjenbrukes og deles med hele bioingeniørsamfunnet. For tiden er MoClo-sett tilgjengelige for planter^{14,15,5,16,17}, sopp^{6,18,19,20,21,22}, bakterier^{7,23,24,25,26,27}og dyr^28,29. En Multi-Kingdom MoClo-plattform har også blitt introdusert nylig³⁰.

For Saccharomyces cerevisiaehar Lee et al.⁶ utviklet et allsidig MoClo-verktøysett, en utmerket ressurs for gjærsyntetisk biologisamfunn. Dette settet kommer i et praktisk 96-brønns format og definerer åtte typer utskiftbare DNA-deler med en mangfoldig samling av godt karakteriserte promotorer, fluorescerende proteiner, terminatorer, peptidkoder, utvalgsmarkører, opprinnelsen til replikasjon og genomredigeringsverktøy. Dette verktøysettet gjør det mulig å montere opptil fem transkripsjonsenheter i en multigenplasmid. Disse funksjonene er verdifulle for gjær metabolsk engineering, der delvise eller hele veier er over-uttrykt for å produsere målrettede kjemikalier. Ved hjelp av dette settet har forskere optimalisert produksjonen av geraniol, linalool³¹, penicillin³², mukonsyre³³, indigo³⁴og betalain³⁵ i gjær.

Her tilbyr vi en detaljert, trinnvis protokoll for å veilede bruken av MoClo-verktøysettet for å generere flergenbaner for enten episomalt eller genomisk uttrykk. Gjennom utstrakt bruk av dette settet har vi funnet ut at nøyaktig måling av DNA-konsentrasjoner er nøkkelen til å sikre likeverdig fordeling av hver del i Golden Gate-reaksjonen. Vi anbefaler også T4 DNA-ligaer over T7 DNA-ligaene fordi førstnevnte fungerer bedre med større antall overheng³⁶. Til slutt må eventuelle interne anerkjennelsessteder for BsmBI og BsaI fjernes eller tammes før montering. Alternativt kan man vurdere å syntetisere deler for å fjerne flere interne nettsteder og for å oppnå samtidig kodonoptimalisering. Vi demonstrerer hvordan du bruker dette verktøysettet ved å uttrykke en fem-gens vei for β-karoten- og lykopenproduksjon i S. cerevisiae. Vi viser videre hvordan du slår ut ADE2-locus ved hjelp av genomredigeringsverktøyene fra dette settet. Disse fargebaserte eksperimentene ble valgt for enkel visualisering. Vi demonstrerer også hvordan man genererer fusjonsproteiner og skaper aminosyremutasjoner ved hjelp av Golden Gate-kloning.

Protocol

MERK: Den hierarkiske kloningsprotokollen som tilbys i dette verktøysettet, kan deles inn i tre hovedtrinn: 1. Kloning av delplasmider; 2. Kloning transkripsjon enheter (TUer); 3. Kloning av multigenplasmider (Figur 1). Denne protokollen starter fra primer design og slutter med anvendelser av klonet multi-gen plasmid. 1. Primer design for kloning av delen plasmid (pYTK001): Design fremre og omvendte primere som inneholder flanke nukleotider TTT på 5 ‘ …

Representative Results

Her resultatene av fire replikerende multi-gen plasmider for β-karoten (gul) og lykopen (rød) produksjon. En integrativ multi-gen plasmid for å forstyrre ADE2 locus ble konstruert, hvis kolonier er røde. Kloning av CDS-er i inngangsvektoren (pYTK001)ERG20 ble forsterket fra gjærgenomet og de tre karotenoidgenene crtE, crtYB, crtI fra plasmid pLM494<sup class=…

Discussion

Det MoClo-baserte kloningssettet utviklet av Lee et al. gir en utmerket ressurs for rask montering av en til fem transkripsjonsenheter i en multigenplasmid enten for replikering eller integrasjon i gjærgenomet. Bruken av dette settet eliminerer den tidkrevende kloning flaskehalsen som ofte eksisterer for å uttrykke flere gener i gjær.

Vi testet fem forskjellige forhold for fordøyelses-/ligasjonssyklusene til Golden Gate-kloning med T4 DNA-ligaer. Vi fant at 30 sykluser av fordøyelsen ved …

Materials

0.5 mm Glass beads	RPI research products	9831	For lysing yeast cells
Bacto Agar	BD & Company	214010	Component of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Bacto Peptone	BD& Company	211677	Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
BsaI-HFv2	New England Biolabs	R3733S	a highly efficient version of BsaI restriction enzyme
Carbenicillin	Fisher Bioreagents	4800-94-6	Antibiotic for screening at the transcription unit level
Chloramphenicol	Fisher Bioreagents	56-75-7	Antibiotic for screening at the entry vector level
CSM-His	Sunrise Sciences	1006-010	Amino acid supplement of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Dextrose	Fisher Chemical	D16-500	Carbon source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids	BD & Company	291940	Nitrogen source of the yeast complete synthetic medium (CSM)
dNTP mix	Promega	U1515	dNTPs for PCR
Esp3I	New England Biolabs	R0734S	a highly efficient isoschizomer of BsmBI
Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit	Zymo Research	T2001	For yeast transformation
Hexanes	Fisher Chemical	H302-1	For carotenoid extraction from yeast cells
Kanamycin	Fisher Bioreagents	25389-94-0	Antibiotic for screening at the multigene plasmid level
LB Agar, Miller	Fisher Bioreagents	BP1425-2	Lysogenic agar medium for E. coli culturing
LB Broth, Miller	Fisher Bioreagents	BP1426-2	Lysogenic liquid medium for E. coli culturing
Lycopene	Cayman chemicals	NC1142173	For lycopene quantification
MoClo YTK	Addgene	1000000061	Depositing Lab: John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep Kit	New England Biolabs	T1010L	For plasmid purification from E.coli
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND2000c	For measuring accurate DNA concentrations
NotI-HF	New England Biolabs	R3189S	Restriction enzyme for integrative multigene plasmid linearization
Nourseothricin Sulphate	Goldbio	N-500-100	Antibiotic Selection marker for the pCAS plasmid used in this study
Phusion HF reaction Buffer (5X)	New England Biolabs	B0518S	Buffer for PCR using Phusion polymerase
Phusion High Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S	High fidelity polymerase for all the PCR reactions
pLM494	Addgene	100539	Plasmid used to amplify crtI, crtYB and crtE used in this study
Quartz Cuvette	Thermo Electron	10050801	For quantifing carotenoids
T4 ligase	New England Biolabs	M0202S	Ligase for Golden Gate cloning
Thermocycler	BIO-RAD	1851148	For performing all the PCR and cloning reactions
Tissue Homogenizer	Bullet Blender	Model: BBX24	For homogenization of yeast cells
UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	Genesys 150	For quantifing carotenoids
Yeast Extract	Fisher Bioreagents	BP1422-500	Component of the yeast extract peptone dextrose medium (YPD)
β-carotene	Alfa Aesar	AAH6010603	For β-carotene quantification