Summary
Denna rapport beskriver ett protokoll för samtidig isolering av primära bruna och vita preadipocytes från nyfödda möss. Isolerade celler kan odlas i kultur och induceras för att skilja sig åt i fullt mogna vita och bruna adipocyter. Metoden möjliggör genetisk, molekylär och funktionell karakterisering av primära fettceller i kulturen.
Abstract
Förståelsen av mekanismerna bakom adipocyte differentiering och funktion har i hög grad gynnats av användningen av odödliga vita preadipocyte cellinjer. Dessa odlade cellinjer har dock begränsningar. De fångar inte helt det olika funktionella spektrumet av de heterogena adipocytpopulationerna som nu är kända för att existera inom vita fettdepåer. För att ge en mer fysiologiskt relevant modell för att studera komplexiteten hos vit fettvävnad har ett protokoll utvecklats och optimerats för att möjliggöra samtidig isolering av primära vita och bruna adipocyt-stamceller från nyfödda möss, deras snabba expansion i kulturen och deras differentiering in vitro till mogna, fullt funktionella adipocyter. Den främsta fördelen med att isolera primära celler från nyfödda, snarare än vuxna möss, är att fettdepåerna aktivt utvecklas och därför är en rik källa till prolifererande preadipocyter. Primära preadipocytes isolerade med detta protokoll skiljer sig snabbt när du når sammanflöde och blir helt mogen i 4-5 dagar, ett tidsmässigt fönster som exakt återspeglar utseendet på utvecklade fettkuddar hos nyfödda möss. Primära kulturer som utarbetas med hjälp av denna strategi kan utökas och studeras med hög reproducerbarhet, vilket gör dem lämpliga för genetiska och fenotypiska skärmar och möjliggör studier av cellautonoma adipocyte fenotyper av genetiska musmodeller. Detta protokoll erbjuder ett enkelt, snabbt och billigt tillvägagångssätt för att studera komplexiteten hos fettvävnad in vitro.
Introduction
Fetma är ett resultat av en kronisk obalans mellan energiintag och energiförbrukning. När fetma utvecklas genomgår vita adipocyter en massiv expansion i cellstorlek som resulterar i hypoxi i mikromiljön, celldöd, inflammation och insulinresistens1. Dysfunktionella, hypertrofierade adipocyter kan inte korrekt lagra överflödiga lipider, som ackumuleras istället i andra vävnader där de dämparinsulinåtgärden 2,3. Medel som förbättrar adipocyte funktion och återställa normala lipid partitionering bland vävnader förutspås vara fördelaktigt för behandling av fetma-associerade villkor som kännetecknas av insulinresistens såsom typ 2 diabetes. Fenotypiska skärmar i adipocyter med hjälp av odödliga cellinjer, såsom 3T3-L1, F442A och 10T 1/2, har visat sig vara användbara för att identifiera genetiska faktorer som reglerar adipogenes och för att isolera pro-adipogenic molekyler med anti-diabetiker egenskaper4,5,6,7. Dessa cellinjer återspeglar dock inte helt heterogeniteten hos celltyper som finns i fettdepåer, vilket inkluderar vita, bruna, beige och andra adipocytundertyper med unika egenskaper, som alla bidrar till systemisk homeostas8,9,10. Vidare visar odlade cellinjer ofta ett minskat svar på yttre stimuli.
Däremot rekapitulerar kulturer av primära adipocyter mer exakt komplexiteten i in vivo adipogenesis, och primära adipocyter visar robusta funktionella svar. Primära preadipocyter isoleras vanligtvis från den stromala vaskulär fraktionen av fettdepåer av vuxna möss11,12,13,14. Men eftersom fettdepåerna hos vuxna djur huvudsakligen består av fullt mogna adipocyter som har en mycket långsamomsättningshastighet 15,16,17, ger detta tillvägagångssätt en begränsad mängd preadipocyter med låg spridningshastighet. Därför är isolering av preadipocyter från nyfödda möss att föredra för att få stora mängder snabbt växande celler som kan differentieras in vitro. Här har ett protokoll beskrivits, inspirerat av det inledande arbetet med primära bruna adipocyter av Kahn et al.18 för att effektivt isolera både vita och bruna preadipocyter som kan utvidgas och differentieras in vitro till fullt fungerande primära adipocyter (Figur 1A). Fördelen med att isolera primära celler från nyfödda, i motsats till vuxna möss, är att fettdepåerna växer snabbt och därmed är en rik källa till aktivt prolifererande preadipocyter17. Celler som isoleras med detta protokoll har hög proliferativ kapacitet, vilket möjliggör snabb uppskalning av kulturer. Dessutom uppvisar preadipocyter från nyfödda valpar högre differentieringspotential än vuxna stamceller, vilket minskar välbefinnandet i differentieringsens omfattning och därmed ökar reproducerbarheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll följer alla IACUC-riktlinjer från The Scripps Research Institute och University of Wisconsin - Madison School of Medicine and Public Health.
1. Insamling och nedsmältning av fettdepåer (dag 1)
- Förbered två 1,5 ml-rör för varje valp: ett för brun fettvävnad (BAT) och ett för vit fettvävnad (WAT). Tillsätt 250 μL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) + 200 μL 2x isoleringsbuffert (123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM CaCl2,5 mM glukos, 100 mM 4-(2-hydroxyetyl)-1-piperazineethanesulfonsyra (HEPES), penicillin-streptomycin och 4% fettsyrafri bovin serum albumin) till varje rör. Håll lösningarna sterila och på is.
- Placera valparna i små kammare (t.ex. en brunn på en 6-brunnsplatta) och ställ dem på is tills de blir hypotermiska. Se till att det inte finns någon direkt kontakt mellan valparna och isen. Pricka en tass med ett tips för att säkerställa förlust av medvetandet och avliva valparna genom halshuggning med skarp sax.
OBS: Om du arbetar med olika genotyper, förbered ytterligare ett rör för att samla en svansbiopsi (3 mm snitt) för genotypning. Om genotypning utförs omedelbart, håll de avlivade valparna på is tills dissekeringen för att samla fettdepåer. - Beräkna och väg ut mängden kollagenas som behövs för att smälta alla depåer. Tillsätt 50 μL 15 mg/ml kollagenas typ I i 2x isoleringsbuffert till varje rör. Återanvänd inte kollagenasen i isoleringsbuffert förrän alla vävnader har samlats in.
- För att samla subkutan WAT, skär huden runt valpens buk (undvik peritoneal bristning) och dra försiktigt ner huden under benen. Utan att ta huden, samla försiktigt fettdepån, som kommer att visas som en klar (P1 eller yngre) eller vit (P2 och äldre), tunn, långsträckt vävnad fäst på insidan eller ovanpå quadriceps (Figur 1B). Skölj fettdepån i PBS och placera den i ett av rören som innehåller 250 μL PBS + 200 μL 2x isoleringsbuffert. Håll dig på is.
OBS: P0- och P1-möss ger bäst utbyte. I P0-1 valpar är den subkutana WAT-depån nästan transparent. Hos P2-möss och äldre är depån lättare att identifiera eftersom den redan blir vit, vilket indikerar närvaron av fullt mogna, lipidbelastade, vita adipocyter. - För att samla interscapular BAT, dra huden från axelbladen över huvudet. Lyft BAT - den djupröda vävnaden mellan axelbladen - och gör försiktigt snitt runt den för att lossa den från kroppen (Figur 1B). Kontrollera om det finns konsekvens och färg. skölj med PBS; placera den i det andra röret som innehåller 250 μL PBS + 200 μL 2x isoleringsbuffert, och håll dig på is.
OBS: När du skördar BAT från P2 möss och äldre, ta försiktigt bort den vita fettvävnaden som omger BAT. Den består av ett tunt, mjukt, vitt ark av adipocyter som ligger mellan huden och BAT, som är djupare mellan axelbladen. - När alla depåer har samlats in, hacka försiktigt varje depå (4-6 gånger) med hjälp av liten sax direkt inuti rören.
- Återanvända kollagenas typ I i lämplig volym av 2x isoleringsbuffert för att erhålla en 10x stamlösning vid 15 mg/ml. Tillsätt 50 μL 10x kollagenas till varje rör och håll rören på is tills kollagenas har tillsatts alla rör.
- Vänd rören snabbt för att blanda och överför till en temperaturstyrd mixer. Inkubera proverna i 30 min vid 37 °C på en skakapparat (1 400 varv/min frekvens för effektiv provblandning).
2. Plätering av preadipocyter (dag 1)
- Efter att ha smält vävnaderna, placera rören tillbaka på is.
OBS: Från och med detta steg utförs allt arbete under sterila förhållanden i ett biosäkerhetsskåp. - Sila de smälta vävnaderna genom en 100 μm cellsil till nya 50 ml-rör. Om du bara arbetar med WT-möss, eller om genotyper är kända, slår du ihop relevanta, dissocierade BATs tillsammans. upprepa detta för WAT: erna. För att maximera cellutbytet, skölj varje rör med 1 ml isoleringsmedium (Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) + 20% fetala bovinserum (FBS), 10 mM HEPES, 1% penicillin-streptomycin) och filtrera det genom cellsilen. Om du arbetar med okända genotyper går du till steg 2.4
OBS: FBS är en viktig determinant för både preadipocyte spridning och differentiering. Testa noggrant olika mängder FBS för att säkerställa hög prestanda och konsekvens mellan partier. - Späd BAT- och WAT-fjädringarna till plåt 2-3 brunnar på en 6-brunnsplatta för varje BAT-prov och 4-6 brunnar av en 6-brunnsplatta för varje WAT-prov. Om till exempel 6 BATs och 6 WATs slogs samman, späd BAT-cellupphängningen upp till 24-36 ml och WAT-cellupphängningen upp till 48-72 ml. Platta 2 ml av cellfjädringarna per brunn.
- För prover med okända genotyper, håll varje prov separat. Placera en 100 μm cellsil ovanpå varje brunn på en 6-brunnsplatta och filtrera ett prov per brunn. Skölj röret med 1,5 ml isoleringsmedium och för det genom silen och gör den slutliga volymen till 2 ml per brunn. Kassera cellsilen, placera locket på plattan och överför plattan till inkubatorn.
OBS: Mediet i brunnarna ska se grumligt ut på grund av flytande blodkroppar, cellskräp och lipider från lysceller. - 1-1,5 timmar efter plätering, aspirera media och tvätta med 2 ml DMEM utan serum. Rör försiktigt om plattan för att lossa blodkroppar från brunnens botten. Efter 3 tvättar, tillsätt 2 ml färskt isoleringsmedium och överför cellerna till inkubatorn (37 °C, 5 % CO2).
OBS: Kontrollera cellerna under mikroskopet. Flytande material (blodkroppar, cellulärt skräp) bör vara minimalt. Bruna preadipocyter kommer att visas som små icke-genomskinliga celler, medan vita preadipocyter kommer att visa en mer långsträckt form. Både bruna och vita preadipocyter ska fästas tätt på plattan.
3. Expansion av preadipocyte kultur (dag 2 till dag 5)
- Nästa dag aspirerar du mediet, tvättar cellerna med 2 ml DMEM utan serum och lägger tillbaka 2 ml isoleringsmedium.
- Upprepa steg 3.1 en gång varannan dag tills cellerna når 80-90% sammanflöde.
OBS: För primära bruna preadipocyter kan det ta 4-5 dagar att nå 80-90% sammanflöde. För primära vita preadipocyter tar det vanligtvis 2-3 dagar. När preadipocyterna når 60% sammanflöde kan de effektivt infekteras med viruspartiklar för knockdown- eller överuttrycksexperiment. Infektera preadipocyter med lämplig virusbelastning i upp till 8 timmar. Användningen av katjonpolymerer för att öka infektionseffektiviteten avskräcks, eftersom det ofta resulterar i toxicitet och i en betydande minskning av den adipogenic potentialen hos infekterade preadipocyter. - För att dela cellerna, täck nya destinationsplattor med en steril lösning på 0,1% w/ v gelatin (upplöst i destillerat vatten; använd ingen värme). Använd tillräckligt med volym för att täcka botten av brunnen / skålen. Inkubera plattor vid 37 °C tills cellerna är redo att sås (minst 10 min).
Obs: Det här steget är valfritt. Beläggning av cellkulturplattor påverkar inte utbytes- eller differentieringspotentialen, men det förenklar avsevärt underhåll och hantering av differentierande adipocyter. - När celler når subkonfluent densitet (85-95%), aspirera mediet, tvätta med PBS och tillsätt trypsin i 3 minuter för att lossa cellerna. Blockera trypsinaktivitet genom att lägga till 2,5x trypsin volym isoleringsmedium. Pipetten cellen fjädring upp och ner för att maximera cellåterställningen och överföra till ett nytt rör. Tvätta brunnarna med 1 ml isoleringsmedium och lägg till det i den första samlingen.
- Centrifugera cellerna i 5 min vid 800-1200 × g, aspirera supernaten och återanvänd cellerna i 3-5 ml isoleringsmediet. Räkna cellerna och späd ut dem till önskad slutlig densitet.
OBS: Till exempel kommer 50 000-80 000 celler/ml (2,5, 1 och 0,5 ml för 6-, 12- respektive 24-brunnsplattor) att resultera i helt sammanflätade brunnar inom 72-96 timmar. - Aspirera beläggningslösningen i steg 3.3 och tvätta bort överflödigt gelatin med PBS. Frö cellerna och sätt tillbaka plattorna i inkubatorn tills de är helt konfluenta.
4. Differentiering av vita och bruna preadipocyter (dag 7 - 12)
- När preadipocyter blir konfluenta, aspirerar mediet och ersätter det med differentieringsmedium bestående av 10% FBS i DMEM som innehåller 170 nM insulin, 1 μM dexametason och 0, 5 mM 3-isobuthyl-1-metylxantin. Om du skiljer BAT-preadipocyter, tillsätt också 1 nM trijodyronin (T3). Markera den dag då adipogenic differentiering induceras som dag 0 av differentiering.
OBS: Både vita och bruna preadipocyter kan spontant skilja sig när de når sammanflöde. För att maximera adipocyte differentiering, bör dock den traditionella pro-adipogenic cocktail som beskrivs ovan (plus T3 för BAT preadipocytes) användas. - Efter 48 h (dag 2 av differentiering), uppdatera mediet med underhållsmedium bestående av 10% FBS i DMEM och 170 nM insulin (plus 1 nM T3 för BAT).
OBS: Dag 2 kan små lipiddroppar som ackumuleras i cellerna under mikroskopet observeras med hjälp av standardljust fält. - Upprepa steg 4.2 en gång varannan dag tills celler används för experiment.
OBS: På dag 4 eller 5 av differentiering kommer majoriteten av cellerna att visas laddade med lipider. Terminalt differentierande adipocyter kan hållas i kulturen längre eller användas i detta skede för experiment.
5. Omplätering för bioenergetikaexperiment
OBS: Om avsikten är att utföra bioenergetikstudier på mogna adipocyter i 96-brunnsformatet måste följande steg vidtas. Helst bör celler som just har helt differentierat (dag 4 eller 5) användas. Förfarandet som beskrivs nedan börjar från 1 brunn av en 6-brunnsplatta.
- Före trypsin matsmältning, förbereda beläggning för 96-brunnsplattor. Tillsätt 50 μL 0,1% gelatin till varje brunn. Lämna plattan i en vävnadskulturinkubator tills cellerna är redo att sås.
- På dag 4 eller 5 av differentiering, aspirera mediet, tvätta med 1 ml PBS och tillsätt 300 μL 0,25% trypsin-etylendiamintetraättika (för 1 brunn av en 6-brunnsplatta). Luta försiktigt plattan för att säkerställa att trypsin helt täcker brunnens botten; inkubera i 2 minuter vid rumstemperatur. Blockera trypsins verkan med 700 μL underhållsmedium, pipett upp och ner för att maximera cellåtervinningen och överför cellfjädringen till ett nytt 1,5 ml-rör.
- Centrifugera cellerna vid 1200 × g i 5 min. Ta bort supernaten, återanvänd pelleten i 1 ml underhållsmedium och räkna cellerna.
OBS: En brunn av en 6-brunnsplatta bör ge cirka 1,5-1,8 miljoner celler. - Späd cellerna så att de har en slutlig koncentration på 60 000 till 80 000 celler/ml för bruna adipocyter och 100 000 till 120 000 celler/ml för vita adipocyter. Platta 100 μL av cellfjädringen per brunn i gelatinbelagda 96-brunnsplattor.
OBS: En brunn på en 6-brunnsplatta ger tillräckligt med celler för upp till två 96-brunnsplattor. För bioenergetikexperiment behövs lågdensitetsplätering (30-40% sammanflöde) för att möjliggöra noggrann mätning av syreförbrukningen och undvika syrebrist i brunnarna under analysen. - Låt cellerna fästa på botten av plattan i minst 48 timmar. Om celler hålls i plattan i mer än 48 timmar, uppdatera mediet efter 2 dagar.
- På testdagen aspirerar du mediet och ersätter det med analysmedium. Inkubera i 1 timme vid 37 °C i en icke-CO2-kontrolleradinkubator och utför analysen enligt tillverkarens instruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Avsnitt 1 i protokollet kommer att ge en heterogen suspension av celler som är synliga under ett standardljusmikroskop. Filtrering av smälta vävnader med cellsil (avsnitt 2) tar bort osmält vävnad. Vissa cellulära skräp, blodkroppar och mogna adipocyter kommer dock att passera (Figur 1C). Skonsamma tvättar 1 timme efter plätering tar bort icke-relevanta celler eftersom preadipocyter fästs snabbt på brunnens botten(figur 1C). I avsnitt 3 utökas adipocytprekursorer för att erhålla det antal celler som krävs för den experimentella planen. Även om både vita och bruna preadipocyter isolerade från nyfödda valpar har hög proliferativ kapacitet, är utbytet av vita preadipocyter i allmänhet dubbelt så högt som för bruna preadipocyter per depå (figur 2A). Därför, om synkroniserade kulturer önskas, måste starttätheten för vita preadipocyter beräknas i enlighet därmed. Avsnitt 4 erbjuder riktlinjer för att få fullt mogna adipocyter.
I slutet av differentieringen kommer cellerna att visas laddade med lipiddroppar respektive uttrycka klassiska markörer av vita respektive bruna adipocyter (figur 2B,C). Både vita och bruna adipocyter kan användas för bioenergetikstudier enligt beskrivningen i avsnitt 5. En jämförande analys av syreförbrukningen i ett mitokondriellt stresstest av primära vita och bruna adipocyter under basala förhållanden, samt som svar på kända stimulatorer av mitokondriell funktion (t.ex. noradrenalin) visas i figur 2D. Vid isolering är det också möjligt att skilja primära vita och bruna adipocyter på plattorna som kommer att användas direkt för bioenergetiska experiment19. I detta fall isoleras preadipocyter och pläteras enligt beskrivningen i avsnitten 1 och 2. När celler blir konfluenta induceras de att differentiera enligt beskrivningen i avsnitt 4 tills de når terminal differentiering och är redo för bioenergetikanalys. Denna procedur är vanlig för ett 24-brunnsplåtformat, men mindre för 96-brunnsplattor.
Figur 1:Insamling och bearbetning avfettkuddar. (A) Schematisk representation av primär vit (överkant) och brun (botten) adipocytisolering. B)Subkutana vita (överst) och bruna (botten) fettdepåer. Hos P0-möss är subkutan WAT nästan osynlig, men blir urskiljbar på ~ dag 2 efter födseln. Bat har däremot en distinkt mörk färg även vid P0. Hos äldre valpar är BAT omgiven av ett tunt ytligt lager av WAT, vilket kräver avlägsnande när vävnaden dissekeras. C)Representativa bilder av primära vita och bruna prekursorceller efter filtrering genom cellsilen 100 μm, efter de första tvättarna och 24 timmar efter isolering. Skalstänger = 100 μm. Förkortningar: WAT = vit fettvävnad; BAT = brun fettvävnad. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Differentiering av adipocytavkomma. (A) Genomsnittligt antal subkutana WAT- och BAT-preadipocyter som erhållits per nyfödd (P0) valp. B)Representativa bilder av terminalt differentierade vita och bruna adipocyter. För fluorescenstomografi inkuberades cellerna med Nile Red och Hoechst 33342 för att färga neutrala lipider respektive atomkärnor. Skalstänger = 100 μm.(C) Genuttrycksanalys av klassiska adipocytmarkörer, vitbeige markörer och brunspecifika markörer i primära vita och bruna adipocyter differentierade i 6 dagar (n=3). För varje gen är BAT-uttrycket relativt WAT-nivåer (inställt på 1). D)OCR av vita och bruna adipocyter i ett mitokondriellt stresstest och som svar på noradrenalin (n=3). Bruna adipocyter visar fri andning och ett robust svar på noradrenalin, medan vita adipocyter visar lite uncoupled andning och inget betydande svar på adrenergic stimulering. *p<0,05; **p<0.01, bestämd av tvåstjärtad students t-test. Förkortningar: WAT = vit fettvävnad; BAT = brun fettvävnad; OCR = syreförbrukningshastighet; Oligo = oligomycin; FCCP = karbonylcyanid-4-(trifluoromethoxy)fenylhydrazon; RAA = rotenon, antimycin A; PPARγ = peroxisom proliferatoraktiverad receptorgamma; Acrp30 = adipocyt komplement-relaterat protein på 30 kDa; Fabp4 = fettsyrabindande protein 4; Glut4 = glukostransportör 4; Cd36 = kluster av differentiering 36; Retn = resistin; Slc27a1 = solute carrier familj 27 medlem 1; Ear2 = eosinofil-associerad, ribonukleas En familj 2; Pgc1a = PPARγ-koaktivator 1alpha; Prdm16 = positiv regulatorisk domän I-bindande faktor 1 (PRDI-BF1) och retinoblastom protein-interagerande zinkfinger gen 1 (RIZ1) homolog domän som innehåller 16; Eva1 = epitelial V-liknande antigen 1; Cidea = celldödsframkallande DNA-fragmenteringsfaktor-alfaliknande effektor A; Ucp1 = frikoppling av protein 1; Dio2 = typ 2 deiodinas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fettvävnad är avgörande för systemisk insulinkänslighet och glukoshomeostas20. Fetma-kopplade adipocyte dysfunktion är tätt associerad med uppkomsten av typ 2 diabetes. Därför kan större förståelse för fettvävnadens grundläggande biologi och fysiologi möjliggöra utformningen av nya behandlingar för metabola störningar. Som ett komplement till direkt funktionell och transkriptionell analys av mogna adipocyter isolerade frånfettdepåer 21,22, odlade primära adipocyter har visat sig rekapitulera många aspekter av fettvävnad patofysiologi, inklusive utsöndring av adipokiner, resistens mot insulin som svar på proinflammatoriska stimuli och induktion av det termogena programmet23,24,25. Även om tidigare protokoll har beskrivit isoleringen av adipocytprekursorer från vuxna möss11,12, ger detta protokoll en metod för effektiv isolering av celler från nyfödda valpar. Denna strategi ger en betydligt större population av vita och bruna adipocyt-stamceller med högre differentieringspotential, eftersom postnatala fettdepåer fortfarande är relativt odifferentierade jämfört med fettdepåerna hos vuxna möss26. Dessutom är celler som isolerats med denna metod redan engagerade och ger fullt fungerande differentierade adipocyter som uttrycker markörer för mogna celler och uppvisar sina unika fysiologiska egenskaper, inklusive lipidlagring och termogen kapacitet.
Primära celler kan inte expanderas på obestämd tid in vitro. Dessutom börjar primära preadipocyter förlora sin adipogenic potential efter flera passager i kulturen. Detta beror sannolikt på att kontinuerlig cellkultur resulterar i en inneboende anrikning av mindre engagerade, mer proliferativa celler. Således är en begränsning av detta protokoll det tidsfönster under vilket preadipocyter kan användas. Adipogenic potential bevaras helt om celler induceras att skilja inom 7-8 dagar från tidpunkten för isolering. Adipocyte stamceller är särskilt resistenta mot enzymatisk matsmältning, men det är ändå viktigt att korrekt tid kollagenas behandling. Över matsmältningsbesvär av vävnader kan leda till minskad cellöverlevnad och minskad förmåga hos celler att hålla fast vid plattan. Under hela expansionsfasen är både vita och bruna preadipocyter starkt vidhäftande och tål kraftiga tvättar och frekvent medieutbyte. Användningen av belagda plattor rekommenderas dock när preadipocyter induceras för att skilja. Mogna, lipid-laddade adipocyter har minskat ytan vidhäftning och cell-cell interaktioner, vilket resulterar i en tendens att lossna under differentiering om inte försiktigt hanteras. Det känsligaste steget i protokollet är induktion av differentiering. FBS, insulin, T3 och andra läkemedel måste testas och deras slutliga koncentrationer optimeras för att uppnå högsta möjliga differentiering. En PPARγ agonist (t.ex. rosiglitazon) kan också läggas till för att ytterligare stimulera adipogenesis.
Det är viktigt att notera att differentieringsförhållandena kan anpassas till de experimentella behoven. Till exempel, i skärmar med genetiska eller kemiska bibliotek utformade för att identifiera proteiner / föreningar som förbättrar vit och / eller brun adipocyte differentiering, preadipocyter kan induceras att skilja med hjälp av ett minimalt tillåtande medium som inkluderar 10% FBS i DMEM och 170 nM insulin endast. Bedömning av varje komponent i differentieringscocktailen rekommenderas för att bestämma idealiska analysfönster för differentieringsanalyser. T3 och dexametason är dispenserbara för primär vit och brun adipocyte differentiering. Dessa villkor kommer att säkerställa en låg differentieringstakt i kontrollceller, vilket ökar fönstret för analysen och maximerar förmågan att upptäcka pro-adipogena faktorer. Kulturer av primära bruna och vita adipocyter är ett kraftfullt verktyg för att förhöra adipocyte cell-autonoma funktion som svar på genetisk manipulation och metaboliska påfrestningar för att komplettera studien av brun och vit fettvävnad in vivo. Därför behövs protokoll för isolering och kultur av primära preadipocyter för att möjliggöra reproducerbara, hög genomströmningsundersökningar av adipocyt funktion in vitro. Den strategi som beskrivs här möjliggör studier av primära vita och bruna preadipocyter som kan differentieras till fullt mogna adipocyter och testas under en mängd olika experimentella manipuleringar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma mot Cristina Godio vid Centro Nacional de Biotecnología i Madrid, Spanien, Mari Gantner vid The Scripps Research Institute, La Jolla, och Anastasia Kralli vid Johns Hopkins University, Baltimore, för hjälp med att optimera detta protokoll baserat på kahn et al.18. Detta arbete finansierades av NIH-bidrag DK114785 och DK121196 till E.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 6-well plates | Corning | 353046 | |
| AdipoRed (Nile Red) | Lonza | PT-7009 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| BenchMark Fetal Bovine Serum | Gemini Bioproducts LLC | 100-106 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| ddH2O | Sigma-Aldrich | 6442 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5030 | For Bioenergetics studies |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Gibco | 10569010 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fatty Acid-Free BSA | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Norepinephrine | Cayman Chemical | 16673 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140122 | |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | 557368 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | For Bioenergetics studies |
| Surgical forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5158 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5880 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | T1317 | |
| triiodothyronine (T3) | Sigma-Aldrich | 642511 |
References
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- McGarry, J. D. Banting lecture 2001: Dysregulation of fatty acid metabolism in the etiology of type 2 diabetes. Diabetes. 51 (1), 7-18 (2002).
- Kusminski, C. M., Bickel, P. E., Scherer, P. E. Targeting adipose tissue in the treatment of obesity-associated diabetes. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 639-660 (2016).
- Waki, H., et al. The small molecule harmine is an antidiabetic cell-type-specific regulator of PPARgamma expression. Cell Metabolism. 5 (5), 357-370 (2007).
- Dominguez, E., et al. Integrated phenotypic and activity-based profiling links Ces3 to obesity and diabetes. Nature Chemical Biology. 10 (2), 113-121 (2014).
- Galmozzi, A., et al. ThermoMouse: an in vivo model to identify modulators of UCP1 expression in brown adipose tissue. Cell Reports. 9 (5), 1584-1593 (2014).
- Ye, L., et al. TRPV4 is a regulator of adipose oxidative metabolism, inflammation, and energy homeostasis. Cell. 151 (1), 96-110 (2012).
- Lynes, M. D., Tseng, Y. H.
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221 (PT Suppl 1), jeb162958 (2018).
- Sponton, C. H., Kajimura, S. Multifaceted roles of beige fat in energy homeostasis beyond UCP1. Endocrinology. 159 (7), 2545-2553 (2018).
- Gao, W., Kong, X., Yang, Q. Isolation, primary culture, and differentiation of preadipocytes from mouse brown adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1566, 3-8 (2017).
- Yu, H., Emont, M., Jun, H., Wu, J. Isolation and differentiation of murine primary brown/beige preadipocytes. Methods in Molecular Biology. (1773), 273-282 (2018).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. (537), 31-46 (2014).
- Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue. Methods in Molecular Biology. (456), 201-219 (2008).
- Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H., Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell. 122 (1), 133-143 (2005).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Kahn, C. R. Isolation and primary culture of brown fat preadipocytes. Sprotocols. , (2014).
- Mills, E. L., et al. Accumulation of succinate controls activation of adipose tissue thermogenesis. Nature. 560 (7716), 102-106 (2018).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Pydi, S. P., et al. Adipocyte β-arrestin-2 is essential for maintaining whole body glucose and energy homeostasis. Nature Communications. 10 (1), 2936 (2019).
- Sun, W., et al. snRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis. Nature. 587 (7832), 98-102 (2020).
- Galmozzi, A., et al. PGRMC2 is an intracellular haem chaperone critical for adipocyte function. Nature. 576 (7785), 138-142 (2019).
- Brown, E. L., et al. Estrogen-related receptors mediate the adaptive response of brown adipose tissue to adrenergic stimulation. iScience. 2, 221-237 (2018).
- Shinoda, K., et al. Genetic and functional characterization of clonally derived adult human brown adipocytes. Nature Medicine. 21 (4), 389-394 (2015).
- Wang, Q. A., Scherer, P. E. The AdipoChaser mouse: A model tracking adipogenesis in vivo. Adipocyte. 3 (2), 146-150 (2014).
