הליכי גונדקטומיה ודגימה בדם במודל טלוסט קטן מדאקה(Oryzias latipes)
Summary
המאמר מתאר פרוטוקול מהיר כדי gonadectomize ולדגום דם מדג הטלוסט הקטן, באמצעות medaka יפני(Oryzias latipes) כמודל, כדי לחקור את התפקיד של סטרואידים מיניים בפיזיולוגיה של בעלי חיים.
Abstract
סטרואידים סקס, המיוצר על ידי האשכים, לשחק תפקיד חיוני במוח ורקמות יותרת המוח פלסטיות, בשליטה neuroendocrine של רבייה בכל בעלי החוליות על ידי מתן משוב למוח ובלוטות יותרת המוח. דגי טלוסט מחזיקים ברמה גבוהה יותר של פלסטיות רקמות וריאציה באסטרטגיות הרבייה בהשוואה ליונקים ונראה שהם מודלים שימושיים לחקור את תפקידם של סטרואידים מיניים ואת המנגנונים שבאמצעותם הם פועלים. הסרת המקור העיקרי של ייצור סטרואידים מיני באמצעות gonadectomy יחד עם דגימת דם כדי למדוד את רמות הסטרואידים כבר מבוסס היטב למדי אפשרי דגים גדולים יותר, היא טכניקה רבת עוצמה לחקור את התפקיד וההשפעות של סטרואידים מיניים. עם זאת, טכניקות אלה מעלות אתגרים כאשר מיושמות במודלים טלוסט בגודל קטן. כאן, אנו מתארים את ההליכים שלב אחר שלב של כריתת גונדקטומיה הן אצל זכרים והן אצל נקבה יפנית מדאקה ואחריו דגימת דם. פרוטוקולים אלה מוצגים להיות אפשרי מאוד medaka המצוין על ידי שיעור הישרדות גבוה, בטיחות על תוחלת החיים ואת פנוטיפ של הדג, רבייה במונחים של אישור סטרואידים מין. השימוש בהליכים אלה בשילוב עם היתרונות האחרים של שימוש במודל טלוסט קטן זה ישפר מאוד את ההבנה של מנגנוני משוב בשליטה הנוירואנדוקרינית של רבייה ופלסטיות רקמות המסופקים על ידי סטרואידים מיניים בחולייתנים.
Introduction
בחולייתנים, סטרואידים מיניים, אשר מיוצרים בעיקר על ידי gonads, לשחק תפקידים חשובים ברגולציה של המוח-יותרת המוח-Gonadal (BPG) ציר באמצעות מנגנוני משוב שונים1,2,3,4,5. בנוסף, סטרואידים מיניים משפיעים על התפשטות ופעילות של נוירונים במוח6,7,8 ותאים אנדוקריניים, כולל גונדוטרופים, בבלוטת יותרת המוח9,10, ובכך משרתים תפקידים מכריעים בפלסטיות המוח ובלוטות יותרת המוח. למרות ידע טוב יחסית ביונקים, המנגנון של ויסות ציר BPG בתיווך סטרואידים מיניים רחוק מלהיות מובן במינים שאינם יונקים, מה שמוביל להבנה לקויה של עקרונות שמורים אבולוציוניים11. יש עדיין מספר מוגבל של מחקרים המתעדים את התפקיד של סטרואידים מיניים על המוח ופלסטיות יותרת המוח, ובכך להעלות את הצורך בחקירות נוספות של התפקיד וההשפעות של סטרואידים מיניים על מינים בעלי חוליות מגוונים.
בקרב בעלי חוליות, teleosts הפכו חיות מודל חזקות בטיפול בשאלות ביולוגיות ופיזיולוגיות רבות, כולל תגובת מתח12,13, צמיחה14,15, פיזיולוגיה תזונתית16,17 ורבייה2. Teleosts, שבו סטרואידים מיני מיוצגים בעיקר על ידי אסטרדיול (E2) אצל נקבות ו 11-ketotestosterone (11-KT) אצל זכרים18,19, כבר זמן רב מודלים ניסיוניים אמינים לחקור את העיקרון הכללי של רבייה על פני מינים. Teleosts להראות ייחודיות שלהם חיבור ההיפותלמוס-יותרת המוח20,21 ותאי גונדוטרופים נפרדים22, אשר לפעמים נוחים להבהרת מנגנונים רגולטוריים. יתר על כן, בשל נוחותם הן לניסויי מעבדה והן לניסויים בשטח, טלוסטים מציעים יתרונות רבים בהשוואה לאורגניזמים אחרים. הם זולים יחסית לרכוש ולתחזק23,24. בפרט, מודלים טלוסט קטנים כגון דגיזברה (דניו rerio) ואת medaka היפני (Oryzias latipes),הם מינים עם פוריות גבוהה מאוד ומחזור חיים קצר יחסית המאפשר ניתוח מהיר של תפקוד גנים ומנגנוני מחלות23,ובכך מספק יתרונות גדולים עוד יותר בטיפול בשפע של שאלות ביולוגיות ופיזיולוגיות, בהתחשב בפרוטוקולים המפותחים הרבים וארגז הכלים הגנטי הזמין למינים אלה25.
במחקרים רבים, הסרת gonads (gonadectomy) יחד עם טכניקות דגימת דם שימשו כשיטה לחקור שאלות פיזיולוגיות רבות, כולל השפעתה על פיזיולוגיה של פוריות חוליות ביונקים26,27,28, ציפורים29 ודו חיים30. למרות ההשפעה gonadectomy על פיזיולוגיה הרבייה יכול להיות לחילופין החיות על ידי אנטגוניסטים סטרואידים מין, כגון טמוקסיפן ו clomiphene, ההשפעה של התרופות נראה לא עקבי עקב השפעות bimodal31,32. חשיפה כרונית אנטגוניסט סטרואידים מין עלול להוביל להגדלת השחלות33,34, אשר עשוי להשבית תצפית של השפעותיו למטרות לטווח ארוך עקב פנוטיפ לא בריא. בנוסף, אי אפשר לבצע ניסוי התאוששות לאחר טיפול אנטגוניסט סטרואידים סקס, כדי להצדיק את ההשפעה הספציפית של סטרואידים מיניים מסוימים. יחד עם אלה נקודות הנ”ל, פשרות אחרות של שימוש אנטגוניסט סטרואידים סקס נבדקו בהרחבה31,32. לכן, gonadectomy עדיין מופיע היום כדכניקה רבת עוצמה לחקור את התפקיד של סטרואידים מיניים.
בעוד שטכניקות גונדכרטומיה ודגימה בדם קלות יחסית לביצוע במינים גדולים יותר, כגון בס ים אירופאי(Dicentrarchus labrax)35, ראסה ראש כחול(תלאסומה ביפסיאטום)36,דגי כלבים(Scyliorhinus)37 ושמנונים(Heteropneustes מאובנים וקלאריאס רחקוס)38,39,הם מעלים אתגרים כאשר מוחלים בדגים קטנים כמו medaka. לדוגמה, השימוש במערכת משלוח הרדמה דגים (FADS)40 הוא פחות ריאלי ונראה נוטה נזק פיזי מוגזם עבור דגים קטנים. בנוסף, הליך כריתת גונדקטומיה המשמש בדרך כלל לדגים גדולים יותר40 אינו מתאים לדגים קטנים הדורש דיוק גבוה כדי למנוע נזק מוגזם. לבסוף, דגימת דם היא מאתגרת בשל הגישה המוגבלת לכלי הדם וכמות הדם הקטנה בבעלי חיים אלה. לכן, פרוטוקול ברור המדגים כל שלב של כריתת גונדקטומיה ודגימה דם בטלוסט קטן הוא בעל חשיבות.
פרוטוקול זה מדגים את ההליכים שלב אחר שלב של כריתת גונדקטומיה ואחריו דגימת דם ב Medaka היפנית, דג מים מתוקים קטן שמקורו במזרח אסיה. Medaka היפני יש גנום רצף, כמה כלים מולקולריים וגנטיים זמינים25, ומערכת קביעת מין גנטי המאפשר לחקור הבדלים מיניים לפני מאפיינים מיניים משניים או gonads מפותחים היטב41. מעניין לציין שמדקה היפנית מחזיקה בגונדים מותכים בניגוד למינים טלוסטים רבים אחרים42. שתי טכניקות אלה יחד לקחת רק 8 דקות בסך הכל וישלים את הרשימה של פרוטוקולי וידאו כבר קיים עבור מין זה שכלל תיוג של כלי הדם43, מהדק תיקון על סעיפים יותרת המוח44 נוירונים במוח45, ותרבות תאיםראשונית 46. טכניקות אלה יאפשרו לקהילת המחקר לחקור ולהבין טוב יותר את התפקידים של סטרואידים מיניים במנגנוני משוב, כמו גם פלסטיות המוח ובלוטות יותרת המוח בעתיד.
Protocol
Representative Results
Discussion
כפי שדווח בספרות קודמת, gonadectomy ודגימה דם שימשו זמן רב במינים מודל אחרים כדי לחקור שאלות הקשורות לתפקיד של סטרואידים מיניים ברגולציה של ציר BPG. עם זאת, טכניקות אלה נראה מקובל רק עבור בעלי חיים גדולים יותר. בהתחשב בגודל הקטן של מודל הטלוסט הנפוץ, medaka יפנית, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור gonadectomy…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לגברת לורדס קאריון ג’י טאן על עזרתה בבעלות הדגים. עבודה זו מומנה על ידי NMBU, מענקים בסיוע מהחברה היפנית לקידום המדע (JSPS) (מענק מספר 18H04881 ו- 18K19323), ומענק לפרויקטים בסיסיים לחקר המדע מקרן סומיטומו ל- S.K.
Materials
| Glass capilary | GD1 | Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige | |
| Heparin sodium salt | H4784-1G | Sigma-aldrich | |
| Needle puller | P97 | Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument | |
| Nylon thread | N45VL | Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun | |
| Plastic tube | T9661 | Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich | |
| Razor blade | – | Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com | |
| Silicone capillary | a16090800ux0403 | Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com | |
| Tricaine | WXBC9102V | Aldrich chemistry |
Riferimenti
- Weltzien, F. -. A., Andersson, E., Andersen, &. #. 2. 1. 6. ;., Shalchian-Tabrizi, K., Norberg, B. The brain-pituitary-gonad axis in male teleosts, with special emphasis on flatfish (Pleuronectiformes). Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 137 (3), 447-477 (2004).
- Yaron, Z., Levavi-Sivan, B., Farrell, A. P. . Encyclopedia of Fish Physiology. 2, 1500-1508 (2011).
- Goldman, B. D. The circadian timing system and reproduction in mammals. Steroids. 64 (9), 679-685 (1999).
- Taranger, G. L., et al. Control of puberty in farmed fish. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 483-515 (2010).
- Messinis, I. E. Ovarian feedback, mechanism of action and possible clinical implications. Human Reproduction Update. 12 (5), 557-571 (2006).
- Diotel, N., et al. The brain of teleost fish, a source, and a target of sexual steroids. Frontiers in Neuroscience. 5, 137 (2011).
- Diotel, N., et al. Steroid Transport, Local Synthesis, and Signaling within the Brain: Roles in Neurogenesis, Neuroprotection, and Sexual Behaviors. Frontiers in Neuroscience. 12, 84 (2018).
- Larson, T. A. Sex Steroids, Adult Neurogenesis, and Inflammation in CNS Homeostasis, Degeneration, and Repair. Frontiers in Endocrinology. 9, 205 (2018).
- Fontaine, R., et al. Gonadotrope plasticity at cellular, population and structural levels: A comparison between fishes and mammals. General and Comparative Endocrinology. 287, 113344 (2020).
- Fontaine, R., Royan, M. R., von Krogh, K., Weltzien, F. -. A., Baker, D. M. Direct and indirect effects of sex steroids on gonadotrope cell plasticity in the teleost fish pituitary. Frontiers in Endocrinology. , (2020).
- Kanda, S. Evolution of the regulatory mechanisms for the hypothalamic-pituitary-gonadal axis in vertebrates-hypothesis from a comparative view. General and Comparative Endocrinology. 284, 113075 (2019).
- Schreck, C. B. Stress and fish reproduction: The roles of allostasis and hormesis. General and Comparative Endocrinology. 165 (3), 549-556 (2010).
- Wendelaar Bonga, S. E. The stress response in fish. Physiological Reviews. 77 (3), 591-625 (1997).
- Mommsen, T. P. Paradigms of growth in fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 129 (2), 207-219 (2001).
- Won, E., Borski, R. Endocrine Regulation of Compensatory Growth in Fish. Front. Endocrinol. 4, 74 (2013).
- MacKenzie, D. S., VanPutte, C. M., Leiner, K. A. Nutrient regulation of endocrine function in fish. Aquaculture. 161 (1), 3-25 (1998).
- Rønnestad, I., Thorsen, A., Finn, R. N. Fish larval nutrition: a review of recent advances in the roles of amino acids. Aquaculture. 177 (1), 201-216 (1999).
- Borg, B. Androgens in teleost fishes. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 109 (3), 219-245 (1994).
- Rege, J., et al. Circulating 11-oxygenated androgens across species. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 190, 242-249 (2019).
- Blázquez, M., Bosma, P. T., Fraser, E. J., Van Look, K. J. W., Trudeau, V. L. Fish as models for the neuroendocrine regulation of reproduction and growth. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Pharmacology, Toxicology and Endocrinology. 119 (3), 345-364 (1998).
- Zambrano, D. Innervation of the teleost pituitary. General and Comparative Endocrinology. 3, 22-31 (1972).
- Weltzien, F. -. A., Hildahl, J., Hodne, K., Okubo, K., Haug, T. M. Embryonic development of gonadotrope cells and gonadotropic hormones – Lessons from model fish. Molecular and Cellular Endocrinology. 385 (1), 18-27 (2014).
- Harris, M. P., Henke, K., Hawkins, M. B., Witten, P. E. Fish is Fish: the use of experimental model species to reveal causes of skeletal diversity in evolution and disease. Journal of applied ichthyology. 30 (4), 616-629 (2014).
- Powers, D. Fish as model systems. Science. 246 (4928), 352-358 (1989).
- Naruse, K., Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. . Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. , 19-37 (2011).
- Green, P. G., et al. Sex Steroid Regulation of the Inflammatory Response: Sympathoadrenal Dependence in the Female Rat. The Journal of Neuroscience. 19 (10), 4082-4089 (1999).
- Pakarinen, P., Huhtaniemi, I. Gonadal and sex steroid feedback regulation of gonadotrophin mRNA levels and secretion in neonatal male and female rats. Journal of Molecular Endocrinology. 3 (2), 139 (1989).
- Purves-Tyson, T. D., et al. Testosterone regulation of sex steroid-related mRNAs and dopamine-related mRNAs in adolescent male rat substantia nigra. BMC Neuroscience. 13 (1), 95 (2012).
- Adkins-Regan, E., Ascenzi, M. Sexual differentiation of behavior in the zebra finch: Effect of early gonadectomy or androgen treatment. Hormones and Behavior. 24 (1), 114-127 (1990).
- McCreery, B. R., Licht, P. Effects of gonadectomy and sex steroids on pituitary gonadotrophin release and response to gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) agonist in the bullfrog, Rana catesbeiana. General and Comparative Endocrinology. 54 (2), 283-296 (1984).
- Clark, J. H., Markaverich, B. M. The agonistic-antagonistic properties of clomiphene: a review. Pharmacology & Therapeutics. 15 (3), 467-519 (1981).
- Mourits, M. J. E., et al. Tamoxifen treatment and gynecologic side effects: a review. Obstetrics & Gynecology. 97 (5), 855-866 (2001).
- Wallach, E., Huppert, L. C. Induction of Ovulation with Clomiphene Citrate. Fertility and Sterility. 31 (1), 1-8 (1979).
- Moradi, B., Kazemi, M. A., Rahamni, M., Gity, M. Ovarian hyperstimulation syndrome followed by ovarian torsion in premenopausal patient using adjuvant tamoxifen treatment for breast cancer. Asian Pacific Journal of Reproduction. 5 (5), 442-444 (2016).
- Alvarado, M. V., et al. Actions of sex steroids on kisspeptin expression and other reproduction-related genes in the brain of the teleost fish European sea bass. The Journal of Experimental Biology. 219 (21), 3353-3365 (2016).
- Godwin, J., Crews, D., Warner, R. R. Behavioural sex change in the absence of gonads in a coral reef fish. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 263 (1377), 1683-1688 (1996).
- Jenkins, N., Dodd, J. M. Effects of ovariectomy of the dogfish Scyliorhinus canicula L. on circulating levels of androgen and oestradiol and on pituitary gonadotrophin content. Journal of Fish Biology. 21 (3), 297-303 (1982).
- Manickam, P., Joy, K. P. Changes in hypothalamic catecholamine levels in relation to season, ovariectomy and 17β-estradiol replacement in the catfish, Clarias batrachus (L.). General and Comparative Endocrinology. 80 (2), 167-174 (1990).
- Senthilkumaran, B., Joy, K. P. Effects of ovariectomy and oestradiol replacement on hypothalamic serotonergic and monoamine oxidase activity in the catfish, Heteropneustes fossilis: a study correlating plasma oestradiol and gonadotrophin levels. Journal of Endocrinology. 142 (2), 193-203 (1994).
- Sladky, K. K., Clarke, E. O. Fish Surgery: Presurgical Preparation and Common Surgical Procedures. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 19 (1), 55-76 (2016).
- Hori, H., Naruse, K., Tanaka, M., Takeda, H. . Medaka: A Model for Organogenesis, Human Disease, and Evolution. , 1-16 (2011).
- Murata, K., Kinoshita, M., Naruse, K., Tanaka, M., Kamei, Y., Murata, K., et al. . Medaka: Biology, Management, and Experimental Protocols. 2, 49-95 (2019).
- Fontaine, R., Weltzien, F. -. A. Labeling of Blood Vessels in the Teleost Brain and Pituitary Using Cardiac Perfusion with a DiI-fixative. Journal of Visualized Experiments. (148), e59768 (2019).
- Fontaine, R., Hodne, K., Weltzien, F. -. A. Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish. Journal of Visualized Experiments. (138), e57790 (2018).
- Zhao, Y., Wayne, N. L. Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish. Journal of Visualized Experiments. (74), e50312 (2013).
- Ager-Wick, E., et al. Preparation of a High-quality Primary Cell Culture from Fish Pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
- Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka – model organism from the far east. Nature Reviews Genetics. 3 (1), 53-64 (2002).
- Kayo, D., Oka, Y., Kanda, S. Examination of methods for manipulating serum 17β-Estradiol (E2) levels by analysis of blood E2 concentration in medaka (Oryzias latipes). General and Comparative Endocrinology. 285, 113272 (2020).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7 (2), 205-213 (2010).
- Velasco-Santamaría, Y. M., Korsgaard, B., Madsen, S. S., Bjerregaard, P. Bezafibrate, a lipid-lowering pharmaceutical, as a potential endocrine disruptor in male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 105 (1-2), 107-118 (2011).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. British Journal of Haematology. 107 (4), 731-738 (1999).
- Zang, L., Shimada, Y., Nishimura, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. Repeated Blood Collection for Blood Tests in Adult Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (102), e53272 (2015).
- Taves, M. D., et al. Steroid concentrations in plasma, whole blood and brain: effects of saline perfusion to remove blood contamination from brain. PloS one. 5 (12), 15727 (2010).
- Holtkamp, H. C., Verhoef, N. J., Leijnse, B. The difference between the glucose concentrations in plasma and whole blood. Clinica Chimica Acta. 59 (1), 41-49 (1975).
- Kanda, S., et al. Identification of KiSS-1 Product Kisspeptin and Steroid-Sensitive Sexually Dimorphic Kisspeptin Neurons in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 149 (5), 2467-2476 (2008).
- Kanda, S., Karigo, T., Oka, Y. Steroid Sensitive kiss2 Neurones in the Goldfish: Evolutionary Insights into the Duplicate Kisspeptin Gene-Expressing Neurones. Journal of Neuroendocrinology. 24 (6), 897-906 (2012).
- Mitani, Y., Kanda, S., Akazome, Y., Zempo, B., Oka, Y. Hypothalamic Kiss1 but Not Kiss2 Neurons Are Involved in Estrogen Feedback in Medaka (Oryzias latipes). Endocrinology. 151 (4), 1751-1759 (2010).
- Kayo, D., Zempo, B., Tomihara, S., Oka, Y., Kanda, S. Gene knockout analysis reveals essentiality of estrogen receptor β1 (Esr2a) for female reproduction in medaka. Scientific Reports. 9 (1), 8868 (2019).
- Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -. A. Plasticity in medaka gonadotropes via cell proliferation and phenotypic conversion. Journal of Endocrinology. 245 (1), 21 (2020).
- Fontaine, R., Ager-Wick, E., Hodne, K., Weltzien, F. -. A. Plasticity of Lh cells caused by cell proliferation and recruitment of existing cells. Journal of Endocrinology. 240 (2), 361 (2019).
- Hasebe, M., Kanda, S., Oka, Y. Female-Specific Glucose Sensitivity of GnRH1 Neurons Leads to Sexually Dimorphic Inhibition of Reproduction in Medaka. Endocrinology. 157 (11), 4318-4329 (2016).
