Gonadectomia e procedure di prelievo del sangue nel modello teleosteo di piccole dimensioni Giapponese Medaka (Oryzias latipes)

Summary

L’articolo descrive un protocollo rapido per gonadectomizzare e campionare il sangue dal piccolo pesce teleosteo, usando il medaka giapponese (Oryzias latipes) come modello, per studiare il ruolo degli steroidi sessuali nella fisiologia animale.

Abstract

Gli steroidi sessuali, prodotti dalle gonidi, svolgono un ruolo essenziale nella plasticità del cervello e del tessuto ipofisario e nel controllo neuroendocrino della riproduzione in tutti i vertebrati fornendo feedback al cervello e all’ipofisi. I pesci teleostei possiedono un più alto grado di plasticità tissutale e variazione nelle strategie riproduttive rispetto ai mammiferi e sembrano essere modelli utili per indagare il ruolo degli steroidi sessuali e i meccanismi con cui agiscono. La rimozione della principale fonte di produzione di steroidi sessuali utilizzando la gonadectomia insieme al prelievo di sangue per misurare i livelli di steroidi è stata ben consolidata e abbastanza fattibile nei pesci più grandi ed è una tecnica potente per indagare il ruolo e gli effetti degli steroidi sessuali. Tuttavia, queste tecniche sollevano sfide se implementate in modelli di teleostei di piccole dimensioni. Qui, descriviamo le procedure passo-passo della gonadectomia sia nei maschi che nelle femmine di medaka giapponese seguite da prelievo di sangue. Questi protocolli si sono dimostrati altamente fattibili in medaka indicato da un alto tasso di sopravvivenza, sicurezza per la durata della vita e fenotipo del pesce e riproducibilità in termini di clearance degli steroidi sessuali. L’uso di queste procedure combinato con gli altri vantaggi dell’utilizzo di questo piccolo modello di teleosteo migliorerà notevolmente la comprensione dei meccanismi di feedback nel controllo neuroendocrino della riproduzione e della plasticità tissutale fornita dagli steroidi sessuali nei vertebrati.

Introduction

Nei vertebrati, gli steroidi sessuali, che sono prodotti principalmente dalle gonadi, svolgono un ruolo importante nella regolazione dell’asse cervello-ipofisi-gonadi (BPG) attraverso vari meccanismi di feedback^1,2,3,4,5. Inoltre, gli steroidi sessuali influenzano la proliferazione e l’attività dei neuroni nel cervello^6,7^,8 e le cellule endocrine, compresi i gonadotropi, nell’ipofisi^9,10e quindi svolgono ruoli cruciali nel cervello e nella plasticità ipofisaria. Nonostante le conoscenze relativamente buone nei mammiferi, il meccanismo di regolazione dell’asse BPG mediato dagli steroidi sessuali è ben lungi dall’essere compreso nelle specie non mammifere, portando a una scarsa comprensione dei principi evolutivi conservati¹¹. C’è ancora un numero limitato di studi che documentano il ruolo degli steroidi sessuali sul cervello e sulla plasticità ipofisaria, aumentando così la necessità di ulteriori indagini sul ruolo e gli effetti degli steroidi sessuali su diverse specie di vertebrati.

Tra i vertebrati, i teleostei sono diventati potenti animali modello nell’affrontare numerose domande biologiche e fisiologiche, tra cui la risposta allo stress^{12,13,la crescita 14,15,}la fisiologia nutrizionale^16,17 e la riproduzione^2. I teleostei, in cui gli steroidi sessuali sono per lo più rappresentati da estradiolo (E2) nelle femmine e 11-chetotestosterone (11-KT) nei maschi^18,19, sono stati a lungo modelli sperimentali affidabili per indagare il principio generale della riproduzione tra le specie. I teleostei mostrano unicità nella loro connessione ipotalamo-ipofisaria^20,21 e distinte cellule gonadotrope²², che a volte sono convenienti per la delucidazione dei meccanismi di regolazione. Inoltre, grazie alla loro suscettibilità sia agli esperimenti di laboratorio che a quello sul campo, i teleostei offrono molti vantaggi rispetto ad altri organismi. Sono relativamente poco costosi da acquistare e mantenere^23,24. In particolare, piccoli modelli di teleostei come il pesce zebra (Danio rerio) e il giapponese medaka (Oryzias latipes), sono specie con una fecondità molto elevata e un ciclo di vita relativamente breve che consente una rapida analisi della funzione genica e dei meccanismi di malattia²³, fornendo così vantaggi ancora maggiori nell’affrontare una pletora di questioni biologiche e fisiologiche, considerando i numerosi protocolli ben sviluppati e toolkit genetici disponibili per queste specie²⁵.

In numerosi studi, la rimozione delle gonidi (gonadectomia) insieme alle tecniche di prelievo del sangue sono state utilizzate come metodo per indagare molte questioni fisiologiche, incluso il suo impatto nella fisiologia riproduttiva dei vertebrati nei mammiferi^26,27,28,uccelli²⁹ e anfibi^30. Sebbene l’effetto della gonadectomia sulla fisiologia riproduttiva possa essere alternativamente imitato da antagonisti degli steroidi sessuali, come il tamoxifene e il clomifene, l’effetto dei farmaci sembra essere incoerente a causa degli effetti bimodali^31,32. L’esposizione cronica a un antagonista steroideo sessuale può portare all’allargamento^ovarico33^,34, che può disabilitare l’osservazione dei suoi effetti a lungo termine a causa di un fenotipo malsano. Inoltre, è impossibile eseguire un esperimento di recupero dopo il trattamento con antagonisti degli steroidi sessuali, per garantire l’effetto specifico di alcuni steroidi sessuali. Insieme a questi punti di cui sopra, altri compromessi dell’uso di antagonisti di steroidi sessuali sono stati ampiamente rivisti^31,32. Pertanto, la gonadectomia appare ancora oggi come una potente tecnica per indagare il ruolo degli steroidi sessuali.

Mentre la gonadectomia e le tecniche di prelievo del sangue sono relativamente facili da eseguire in specie più grandi, come il branzino europeo (Dicentrarchus labrax)³⁵, il labbro blu (Thalassoma bifasciatum)³⁶, il pesce cane (Scyliorhinus canicula)³⁷ e il pesce gatto (Heteropneustes fossilis e Clarias bathracus)^38,39, sollevano sfide quando applicati in piccoli pesci come medaka. Ad esempio, l’uso del Fish Anesthesia Delivery System (FADS)⁴⁰ è meno fattibile e sembra essere soggetto a danni fisici eccessivi per i piccoli pesci. Inoltre, una procedura di gonadectomia comunemente usata per i pesci più grandi⁴⁰ non è adatta per i pesci piccoli che richiedono un’elevata precisione per evitare danni eccessivi. Infine, il prelievo di sangue è impegnativo a causa dell’accesso limitato ai vasi sanguigni e della piccola quantità di sangue in quegli animali. Pertanto, un protocollo chiaro che dimostri ogni fase della gonadectomia e del prelievo di sangue in un piccolo teleosteo è importante.

Questo protocollo dimostra le procedure passo-passo della gonadectomia seguite dal prelievo di sangue nel medaka giapponese, un piccolo pesce d’acqua dolce originario dell’Asia orientale. I medaka giapponesi hanno un genoma sequenziato, diversi strumenti molecolari e genetici disponibili²⁵e un sistema di determinazione genetica del sesso che consente di esaminare le differenze sessuali prima che le caratteristiche sessuali secondarie o le gonde siano ben sviluppate⁴¹. È interessante notare che i medaka giapponesi possiedono gondi fuse contrariamente a molte altre specie di teleostei⁴². Queste due tecniche combinate richiedono solo 8 minuti in totale e completeranno l’elenco dei protocolli video già esistenti per questa specie che includeva l’etichettatura dei vasi sanguigni⁴³, patch-clamp sulle sezioni ipofisarie⁴⁴ e neuroni cerebrali⁴⁵e la coltura cellulare primaria⁴⁶. Queste tecniche consentiranno alla comunità di ricerca di indagare e comprendere meglio i ruoli degli steroidi sessuali nei meccanismi di feedback, nonché la plasticità cerebrale e ipofisaria in futuro.

Protocol

Tutte le sperimentazioni e la manipolazione degli animali sono state condotte in conformità con le raccomandazioni sul benessere animale sperimentale presso l’Università norvegese di scienze della vita. Gli esperimenti con gonadectomia sono stati approvati dall’Autorità norvegese per la sicurezza alimentare (FOTS ID 24305). NOTA: Gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando medaka giapponesi maschi e femmine adulti (6-7 mesi, peso circa 0,35 g, lunghezza circa 2,7 cm). Il sesso è stato …

Representative Results

Questo protocollo descrive ogni fase per l’esecuzione della gonadectomia e del prelievo di sangue in un teleosteo modello di piccole dimensioni, il medaka giapponese. Il tasso di sopravvivenza del pesce dopo ovariectomia (OVX) nelle femmine è del 100% (10 su 10 pesci) mentre il 94% (17 su 18 pesci) dei maschi è sopravvissuto dopo orchidectomia. Nel frattempo, dopo che è stata eseguita la procedura di prelievo del sangue, tutti i pesci (38 pesci) sono sopravvissuti. <p class="jove_c…

Discussion

Come riportato nella letteratura precedente, la gonadectomia e il prelievo di sangue sono stati a lungo utilizzati in altre specie modello per indagare domande relative al ruolo degli steroidi sessuali nella regolazione dell’asse BPG. Tuttavia, queste tecniche sembrano essere suscettibili solo per gli animali più grandi. Considerando le piccole dimensioni del modello di teleosteo comunemente usato, il medaka giapponese, forniamo un protocollo dettagliato per la gonadectomia e il prelievo di sangue che è fattibile per q…

Materials

Glass capilary		GD1	Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige
Heparin sodium salt		H4784-1G	Sigma-aldrich
Needle puller		P97	Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument
Nylon thread		N45VL	Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun
Plastic tube		T9661	Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich
Razor blade		–	Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com
Silicone capillary		a16090800ux0403	Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com
Tricaine		WXBC9102V	Aldrich chemistry