Procedimentos de Gonadectomia e Amostragem de Sangue no Modelo teleost de pequeno tamanho Japonês Medaka (Oryzias latipes)

Summary

O artigo descreve um protocolo rápido para gonadectomizar e provar sangue do pequeno peixe teleost, usando medaka japonês (Oryzias latipes) como modelo, para investigar o papel dos esteroides sexuais na fisiologia animal.

Abstract

Os esteroides sexuais, produzidos pelas gôndas, desempenham um papel essencial na plasticidade do cérebro e do tecido pituitário e no controle neuroendócrino da reprodução em todos os vertebrados, fornecendo feedback ao cérebro e à hipófise. Os peixes teleost possuem um maior grau de plasticidade tecidual e variação nas estratégias reprodutivas em comparação com os mamíferos e parecem ser modelos úteis para investigar o papel dos esteroides sexuais e os mecanismos pelos quais atuam. A remoção da principal fonte de produção de esteroides sexuais usando gonadectomia juntamente com amostragem de sangue para medir os níveis de esteroides tem sido bem estabelecida e bastante viável em peixes maiores e é uma técnica poderosa para investigar o papel e os efeitos dos esteroides sexuais. No entanto, essas técnicas levantam desafios quando implementadas em modelos teleost de pequeno porte. Aqui, descrevemos os procedimentos passo a passo da gonadectomia em ambos os machos e fêmeas medaka japonesa seguidos de amostragem de sangue. Estes protocolos são mostrados altamente viáveis em medaka indicado por uma alta taxa de sobrevivência, segurança para o tempo de vida e fenótipo do peixe, e reprodutibilidade em termos de liberação de esteroides sexuais. O uso desses procedimentos combinados com as outras vantagens do uso deste pequeno modelo teleost melhorará muito a compreensão dos mecanismos de feedback no controle neuroendócrino da reprodução e plasticidade tecidual proporcionada por esteroides sexuais em vertebrados.

Introduction

Em vertebrados, os esteroides sexuais, que são produzidos principalmente pelas gôndas, desempenham papéis importantes na regulação do eixo Brain-Pituitary-Gonadal (BPG) através de vários mecanismos de feedback^1,2,3,4,5. Além disso, os esteroides sexuais afetam a proliferação e a atividade de neurônios no cérebro^6,7,8 e células endócrinas, incluindo gonadotropes, na pituitária^9,10, e assim servem papéis cruciais na plasticidade cerebral e pituitária. Apesar do conhecimento relativamente bom em mamíferos, o mecanismo de regulação do eixo BPG mediado por esteroides sexuais está longe de ser compreendido em espécies não-mamíferas, levando à má compreensão dos princípios evolutivos conservados¹¹. Ainda há um número limitado de estudos documentando o papel dos esteroides sexuais na plasticidade cerebral e pituitária, aumentando assim a necessidade de investigações adicionais sobre o papel e os efeitos dos esteroides sexuais em diversas espécies de vertebrados.

Entre os vertebrados, as teleostas tornaram-se animais modelo poderosos no enfrentamento de inúmeras questões biológicas e fisiológicas, incluindo resposta ao estresse^12,13, crescimento^14,15, fisiologia nutricional^16,17 e reprodução². Teleosts, nos quais os esteroides sexuais são representados principalmente por estradiol (E2) em fêmeas e 11-cetosetosterona (11-KT) em machos^18,19, têm sido modelos experimentais confiáveis para investigar o princípio geral da reprodução entre espécies. As teleóstas mostram singularidade em sua conexão hipotalâmica-pituitária^20,21 e distintas células gonadotrope²², que às vezes são convenientes para a elucidação de mecanismos regulatórios. Além disso, devido à sua comodidade tanto para experimentos de laboratório quanto de campo, os teleosts oferecem muitas vantagens em comparação com outros organismos. Eles são relativamente baratos para comprar e manter^23,24. Em particular, pequenos modelos de teleost como o zebrafish (Danio rerio) e o medaka japonês (Oryzias latipes), são espécies com fecundidade muito alta e um ciclo de vida relativamente curto, permitindo a análise rápida da função genética e mecanismos de doença²³, proporcionando assim vantagens ainda maiores no enfrentamento de uma infinidade de questões biológicas e fisiológicas, considerando os inúmeros protocolos bem desenvolvidos e kit de ferramentas genéticas disponíveis para essas espécies²⁵.

Em inúmeros estudos, a remoção de gônadas (gonadectomia) juntamente com técnicas de amostragem de sangue têm sido utilizadas como método para investigar muitas questões fisiológicas, incluindo seu impacto na fisiologia reprodutiva de vertebrados nos mamíferos^26,27,28, aves²⁹ e anfíbios³⁰. Embora o efeito gonadectomia na fisiologia reprodutiva possa ser imitado alternativamente por antagonistas de esteroides sexuais, como tamoxifen e clomifeno, o efeito das drogas parece ser inconsistente devido aos efeitos bimodais^31,32. A exposição crônica a um antagonista de esteroides sexuais pode levar ao alargamento ovariano^33,34, que pode desativar a observação de seus efeitos para fins de longo prazo devido a um fenótipo não saudável. Além disso, é impossível realizar um experimento de recuperação após o tratamento antagonista de esteroides sexuais, para justificar o efeito específico de certos esteroides sexuais. Junto com esses pontos acima mencionados, outras trocas de uso de antagonistas de esteroides sexuais foram amplamente revisadas^31,32. Portanto, a gonadectomia ainda aparece hoje como uma técnica poderosa para investigar o papel dos esteroides sexuais.

Enquanto as técnicas de gonadectomia e amostragem de sangue são relativamente fáceis de executar em espécies maiores, como o robalo europeu (Dicentrarchus labrax)³⁵, o tálamo azul(Thalassoma bifasciatum)³⁶, o dogfish(Scyliorhinus canicula)³⁷ e o bagre(Heteropneustes fossilis e Clarias bathracus)^38,39, eles levantam desafios quando aplicados em peixes pequenos como medaka. Por exemplo, o uso do Fish Anesthesia Delivery System (FADS)⁴⁰ é menos viável e parece ser propenso a danos físicos excessivos para peixes pequenos. Além disso, um procedimento de gonadectomia que é comumente usado para peixes maiores⁴⁰ não é adequado para peixes pequenos que requer alta precisão para evitar danos excessivos. Finalmente, a amostragem de sangue é desafiadora devido ao acesso limitado aos vasos sanguíneos e à pequena quantidade de sangue nesses animais. Portanto, um protocolo claro demonstrando cada passo de gonadectomia e amostragem de sangue em um pequeno teleost é importante.

Este protocolo demonstra os procedimentos passo a passo da gonadectomia seguidos pela amostragem de sangue em medaka japonesa, um pequeno peixe de água doce nativo do leste da Ásia. Medaka japonesa tem um genoma sequenciado, várias ferramentas moleculares e genéticas disponíveis²⁵, e um sistema de determinação genética de sexo que permite a investigação de diferenças sexuais antes que características sexuais secundárias ou gônadas sejam bem desenvolvidas⁴¹. Curiosamente, medaka japonesa possui gônadas fundidas contrárias a muitas outras espécies de teleost⁴². Essas duas técnicas combinadas levam apenas 8 minutos no total e completarão a lista de protocolos de vídeo já existentes para esta espécie que incluía rotulagem de vasos sanguíneos^43,grampo de remendo nas seções pituitárias⁴⁴ e neurônios cerebrais⁴⁵, e cultura celular primária⁴⁶. Essas técnicas permitirão que a comunidade de pesquisa investigue e entenda melhor os papéis dos esteroides sexuais em mecanismos de feedback, bem como na plasticidade cerebral e pituitária no futuro.

Protocol

Todas as experimentações e manejo animal foram conduzidas de acordo com as recomendações sobre o bem-estar animal experimental na Universidade Norueguesa de Ciências da Vida. Os experimentos com a gonadectomia foram aprovados pela Autoridade Norueguesa de Segurança Alimentar (FOTS ID 24305). NOTA: Os experimentos foram realizados utilizando-se medaka adulto masculino e feminino (6-7 meses de idade, peso de 0,35 g, comprimento de 2,7 cm) medaka japonês. O sexo foi determinado por disting…

Representative Results

Este protocolo descreve cada passo para a realização de gândectomia e amostragem de sangue em um teleost modelo de pequeno tamanho, o medaka japonês. A taxa de sobrevivência dos peixes após a ovariectomia (OVX) nas fêmeas é de 100% (10 em cada 10 peixes), enquanto 94% (17 dos 18 peixes) dos machos sobreviveram após orquídea. Enquanto isso, após a realização do procedimento de amostragem de sangue, todos os peixes (38 peixes) sobreviveram. <p class="jove_content" fo:keep-t…

Discussion

Como relatado na literatura anterior, a gonadectomia e a amostragem de sangue têm sido utilizadas há muito tempo em outras espécies modelo para investigar questões relacionadas ao papel dos esteroides sexuais na regulação do eixo BPG. No entanto, essas técnicas parecem ser favoráveis apenas para animais maiores. Considerando o pequeno tamanho do modelo teleost comumente usado, medaka japonês, fornecemos um protocolo detalhado para gonadectomia e amostragem de sangue que é viável para esta espécie.

<p clas…

Materials

Glass capilary		GD1	Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige
Heparin sodium salt		H4784-1G	Sigma-aldrich
Needle puller		P97	Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument
Nylon thread		N45VL	Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun
Plastic tube		T9661	Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich
Razor blade		–	Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com
Silicone capillary		a16090800ux0403	Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com
Tricaine		WXBC9102V	Aldrich chemistry