बेकर के खमीर सैचरोमाइसेस सेरेविसिया में माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम अभिव्यक्ति उत्पादों की लेबलिंग और विज़ुअलाइज़ेशन
Summary
बेकर के खमीर माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम आठ पॉलीपेप्टाइड्स को एन्कोड करते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल का लक्ष्य उन सभी को लेबल करना और बाद में उन्हें अलग बैंड के रूप में कल्पना करना है।
Abstract
माइटोकॉन्ड्रिया एरोबिक श्वसन में सक्षम यूकेरियोटिक कोशिकाओं के आवश्यक ऑर्गेनेल्स हैं। इनमें गोलाकार जीनोम और जीन अभिव्यक्ति उपकरण होते हैं। बेकर के खमीर का एक माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम आठ प्रोटीन को एन्कोड करता है: साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेस (कॉक्स1पी, के तीन उपइकाइट्स कॉक्स 2पी, और कॉक्स 3पी), एटीपी सिंथेस (Atp6p, Atp8p, और Atp9p), ubiquinol-cytochrome c ऑक्सीडोरेक्टेज एंजाइम, साइटोक्रोम बी (Cytb), और माइटोकॉन्ड्रियल रिबोसोमल प्रोटीन Var1p की एक उपइकांत । यहां वर्णित विधि का उद्देश्य विशेष रूप से इन प्रोटीनों को 35एस मेथियोनिन के साथ लेबल करना है, उन्हें इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग करना और स्क्रीन पर असतत बैंड के रूप में संकेतों की कल्पना करना है। प्रक्रिया में कई कदम शामिल हैं। सबसे पहले, खमीर कोशिकाओं को एक गैलेक्टोज युक्त माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है जब तक कि वे देर से लॉगरिथम विकास चरण तक नहीं पहुंच जाते। इसके बाद, साइक्लोहेक्सिमाइड उपचार साइटोप्लाज्मिक अनुवाद को अवरुद्ध करता है और केवल माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद उत्पादों में 35एस मेथियोनिन निगमन की अनुमति देता है। फिर, सभी प्रोटीन खमीर कोशिकाओं से निकाले जाते हैं और पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग किए जाते हैं। अंत में, जेल को सूखे और भंडारण फॉस्फोर स्क्रीन के साथ इनक्यूबेटेड किया जाता है। बैंड का खुलासा करने वाले फॉस्फोरमगर पर स्क्रीन को स्कैन किया जाता है। विधि को जंगली प्रकार बनाम उत्परिवर्ती खमीर तनाव के माइटोकॉन्ड्रिया में एक एकल पॉलीपेप्टाइड की बायोसिंथेसिस दर की तुलना करने के लिए लागू किया जा सकता है, जो माइटोकॉन्ड्रियल जीन अभिव्यक्ति दोषों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है। यह प्रोटोकॉल सभी खमीर माइटोकॉन्ड्रियल mRNAs के अनुवाद दर के बारे में मूल्यवान जानकारी देता है। हालांकि, उचित निष्कर्ष निकालने के लिए कई नियंत्रणों और अतिरिक्त प्रयोगों की आवश्यकता होती है।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रिया एक यूकेरियोटिक सेल के मेटाबोलिज्म में गहराई से शामिल ऑर्गेनेल्स हैं। उनकी इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर चेन एटीपी के साथ सेल की आपूर्ति करती है, जो कई जैव रासायनिक रास्तों में उपयोग की जाने वाली मुख्य ऊर्जावान मुद्रा है। इसके अलावा, वे एपोप्टोसिस, फैटी एसिड और हेम संश्लेषण, और अन्य प्रक्रियाओं में शामिल हैं। माइटोकॉन्ड्रिया की शिथिलता मानव रोग का एक प्रसिद्ध स्रोत है1. इसके परिणामस्वरूप नाभिकीय या माइटोकॉन्ड्रियल जीन में म्यूटेशन हो सकता है जो ऑर्गेनेल्स2के संरचनात्मक या नियामक घटकों को एन्कोडिंग करते हैं । बेकर का खमीर सैचरोमाइसेस सेरेविसिया कई कारणों से माइटोकॉन्ड्रियल जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है। सबसे पहले, उनके जीनोम पूरी तरह सेअनुक्रम 3,अच्छी तरह से एनोटेटेड है, और डेटा का एक बड़ा योग पहले से ही इस जीव के साथ किए गए जांच के लंबे इतिहास के लिए धंयवाद साहित्य में उपलब्ध है । दूसरा, उनके परमाणु जीनोम के साथ जोड़तोड़ अपेक्षाकृत तेज और उनकी तेजी से विकास दर और अत्यधिक कुशल अनुरूप पुनर्संयोजन प्रणाली की वजह से आसान कर रहे हैं । तीसरा, बेकर का खमीर एस सेरेविसिया उन कुछ जीवों में से एक है जिनके लिए माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम के साथ जोड़तोड़ विकसित किए जाते हैं। अंत में, बेकर का खमीर एक एरोब-एनारोब संकाय जीव है, जो श्वसन दोषपूर्ण म्यूटेंट के अलगाव और अध्ययन की अनुमति देता है, क्योंकि वे किण्वित कार्बन स्रोतों वाले मीडिया में विकसित हो सकते हैं।
हम ट्रांसलेशनल स्तर 4 पर बेकर के खमीर एस सेरेविसिया की माइटोकॉन्ड्रियल जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने की विधि का वर्णन करतेहैं। इसका मुख्य सिद्धांत कई टिप्पणियों से आता है। सबसे पहले, खमीर माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम केवल आठ प्रोटीन को एन्कोड करता है: साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेस (कॉक्स 1प, के तीन उपइकाइट्स कॉक्स 2पी, और कॉक्स 3पी), एटीपी सिंथेस (Atp6p, Atp8p, और Atp9p), ubiquinol-cytochrome c ऑक्सीडोरेक्टेज एंजाइम, साइटोक्रोम बी (Cytb), और माइटोकॉन्ड्रियल रिबोसोमल प्रोटीन Var1p5की एक उपइकांत । यह संख्या छोटी है, और उन सभी को उचित परिस्थितियों में एक ही जेल पर इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग किया जा सकता है। दूसरा, माइटोकॉन्ड्रियल राइबोसोम यूकेरियोटिक6के बजाय प्रोकैरियोटिक वर्ग से संबंधित हैं, और इसलिए, एंटीबायोटिक दवाओं के प्रति संवेदनशीलता खमीर साइटोप्लाज्मिक और माइटोकॉन्ड्रियल राइबोसोम्स के लिए अलग है। यह साइक्लोहेक्सिमाइड के साथ साइटोप्लाज्मिक अनुवाद के अवरोध की अनुमति देता है, जब लेबल किए गए अमीनो एसिड(35एस-मेथियोनिन) को केवल माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद उत्पादों में शामिल किया जाता है। नतीजतन, प्रयोग माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन संश्लेषित डी नोवो में अमीनो एसिड निगमन की दर के बारे में जानकारी देता है, जो आठ उत्पादों में से प्रत्येक के लिए माइटोकॉन्ड्रियल अनुवाद की समग्र दक्षता को दर्शाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
जीन अभिव्यक्ति की जांच आधुनिक जीवन विज्ञान में एक केंद्रीय भाग पर कब्जा । इस जटिल प्रक्रिया में अंतर्दृष्टि प्रदान करने वाले कई तरीके विकसित किए गए हैं। यहां, हमने बेकर के खमीर एस सेरेविसिया माइटो?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को रूसी फाउंडेशन फॉर बेसिक रिसर्च, ग्रांट नंबर 18-29-07002 द्वारा वित्त पोषित किया गया था । पीके को रूसी संघ के विज्ञान और उच्च शिक्षा मंत्रालय के राज्य असाइनमेंट, अनुदान संख्या एए-ए16-116021660073-5 द्वारा समर्थित किया गया था । M.V.P. को रूसी संघ के विज्ञान और उच्च शिक्षा मंत्रालय द्वारा समर्थित किया गया था, अनुदान संख्या 075-15-2019-1659 (कुचतोव सेंटर ऑफ जीनोम रिसर्च का कार्यक्रम)। काम आंशिक रूप से विकास के मास्को राज्य विश्वविद्यालय कार्यक्रम के फ्रेम में खरीदा उपकरणों पर किया गया था । I.C, S.L., और M.V..B अतिरिक्त मास्को राज्य विश्वविद्यालय अनुदान “अग्रणी वैज्ञानिक स्कूल नूह के संदूक” द्वारा समर्थित थे ।
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | A9099 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306 | |
| Biowave Cell Density Meter CO8000 | BIOCHROM US BE | 80-3000-45 | |
| BRAND standard disposable cuvettes | Sigma-Aldrich | Z330361 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C1988 | |
| D-(+)-Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| digital block heater | Thermo Scientific | 88870001 | |
| EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution | Perkin Elmer | NEG709A500UC | |
| Eppendorf Centrifuge 5425 | Thermo Scientific | 13-864-457 | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE29-0171-33 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7279 | |
| New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator | New Brunswick Scientific | ||
| Peptone from meat, bacteriological | Millipore | 91249 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Pierce 660nm Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 22662 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Protean II xi cell | Bio-Rad | 1651802 | |
| Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Storm 865 phosphor imager | GE Healthcare | ||
| Trizma base | Sigma-Aldrich | 93352 | |
| Vacuum Heated Gel Dryer | Cleaver Scientific | CSL-GDVH | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
Riferimenti
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).
- Park, C. B., Larsson, N. G. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging. The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).
- Goffeau, A., et al. Life with 6000 genes. Science. 274 (5287), 546-563 (1996).
- Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast. Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).
- Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).
- Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. The structure of the yeast mitochondrial ribosome. Science. 355 (6324), 528-531 (2017).
- Sasarman, F., Shoubridge, E. A. Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells. Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).
- Kuzmenko, A., et al. Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis. Science Reports. 6, 18749 (2016).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Keil, M., et al. Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).
- Singhal, R. K., et al. Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex. Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).
- Mick, D. U., et al. Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria. The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).
- Bietenhader, M., et al. Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution. PLoS Genetics. 8 (8), e1002876 (2012).
- Couvillion, M. T., Churchman, L. S. Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo. Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).
- Suhm, T., et al. A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast. Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).
