Rotulagem e Visualização de Produtos de Expressão do Genoma Mitocondrial no Saccharomyces cerevisiae de Levedura de Baker

Summary

O genoma mitocondrial da levedura de Baker codifica oito polipeptídeos. O objetivo do protocolo atual é rotular todos eles e, posteriormente, visualizá-los como bandas separadas.

Abstract

Mitocôndrias são organelas essenciais de células eucarióticas capazes de respiração aeróbica. Eles contêm genoma circular e aparelho de expressão genética. Um genoma mitocondrial da levedura do padeiro codifica oito proteínas: três subunidades do citocromome c oxidase (Cox1p, Cox2p, e Cox3p), três subunidades da ATP synthase (Atp6p, Atp8p e Atp9p), uma subunidade da enzima ubiquinol-citocromo c oxidoreductase, citocromo b (Cytb) e proteína ribossômica mitocondrial Var1p. O objetivo do método descrito aqui é rotular especificamente essas proteínas com methionina ³⁵S, separá-las por eletroforese e visualizar os sinais como bandas discretas na tela. O procedimento envolve várias etapas. Primeiro, as células de levedura são cultivadas em um meio contendo galactose até chegarem ao estágio de crescimento logarítmico tardio. Em seguida, o tratamento de cicloheximida bloqueia a tradução citoplasmática e permite a incorporação de metionina ³⁵S apenas em produtos de tradução mitocondrial. Em seguida, todas as proteínas são extraídas de células de levedura e separadas por eletroforese de gel de poliacrilamida. Finalmente, o gel é seco e incubado com a tela de fósforo de armazenamento. A tela é escaneada em um fosphorimager revelando as bandas. O método pode ser aplicado para comparar a taxa de biossíntese de um único polipeptídeo nas mitocôndrias de uma cepa de levedura mutante versus o tipo selvagem, o que é útil para estudar defeitos de expressão genética mitocondrial. Este protocolo fornece informações valiosas sobre a taxa de tradução de todas as mRNAs mitocondrial de leveduras. No entanto, requer vários controles e experimentos adicionais para tirar conclusões adequadas.

Introduction

Mitocôndrias são as organelas profundamente envolvidas no metabolismo de uma célula eucariótica. Sua cadeia de transferência de elétrons fornece a célula com ATP, a principal moeda energética usada em múltiplas vias bioquímicas. Além disso, estão envolvidos em apoptose, ácido graxo e síntese de heme, entre outros processos. A disfunção das mitocôndrias é uma fonte bem conhecida da doença humana¹. Pode resultar de mutações em genes nucleares ou mitocondriais codificando componentes estruturais ou regulatórios das organelas². O saccharomyces cerevisiae de baker é um excelente organismo modelo para estudar a expressão genética mitocondrial devido a várias razões. Primeiro, seu genoma é completamente sequenciado³, bem anotado, e uma grande soma de dados já está disponível na literatura graças à longa história de investigações realizadas com esse organismo. Em segundo lugar, as manipulações com seu genoma nuclear são relativamente rápidas e fáceis devido à sua taxa de crescimento rápido e sistema de recombinação homólogo altamente eficiente. Em terceiro lugar, a levedura de padeiro S. cerevisiae é um dos poucos organismos para os quais as manipulações com genomas mitocondriais são desenvolvidas. Finalmente, a levedura do padeiro é um organismo facultativo aerobe-anaerobe, que permite o isolamento e o estudo de mutantes com defeito respiratório, uma vez que eles podem crescer em mídia contendo fontes de carbono fermentáveis.

Descrevemos o método para estudar a expressão genética mitocondrial da levedura de padeiro S. cerevisiae no nível translacional⁴. Seu princípio principal vem de várias observações. Primeiro, o genoma mitocondrial da levedura codifica apenas oito proteínas: três subunidades do citocromo c oxidase (Cox1p, Cox2p, e Cox3p), três subunidades da ATP synthase (Atp6p, Atp8p e Atp9p), uma subunidade da enzima ubiquinol-citocromo c oxidoreductase, citocromo b (Cytb), e proteína ribossômica mitocondrial Var1p⁵. Este número é pequeno, e todos eles podem ser separados por eletroforese em um único gel nas condições apropriadas. Em segundo lugar, ribossomos mitocondriais pertencem à classe procariótica em vez de eucariótico⁶, e, portanto, a sensibilidade aos antibióticos é diferente para ribossmos citoplasmáticos e mitocondriais de levedura. Permite a inibição da tradução citoplasmática com cicloheximida, proporcionando as condições quando o aminoácido rotulado (³⁵S-methionina) é incorporado apenas em produtos de tradução mitocondrial. Como resultado, o experimento fornece informações sobre a taxa de incorporação de aminoácidos em proteínas mitocondriais sintetizadas de novo, refletindo a eficiência global da tradução mitocondrial para cada um dos oito produtos

Protocol

1. Preparação da cultura da levedura Leveduras de listras das culturas de estoque congelado em placas frescas com o meio apropriado. Coloque as placas em uma incubadora de cultura a 30 °C para 24-48 h.NOTA: Deixe os mutantes sensíveis à temperatura crescerem na temperatura permissiva. Culturas de levedura inoculada em 2 mL de meio YPGal (2% peptone, 1% extrato de levedura, 2% galactose) da raia fresca em tubos de 15 mL e incubar-as durante a noite agitando a 200 rpm a 30 °C. Meça …

Representative Results

Seguindo o protocolo descrito acima, atribuímos produtos de tradução mitocondrial de duas cepas de S. cerevisiae: o tipo selvagem(WT) e uma exclusão de rolamento mutante do gene AIM23 (AIM23Δ),codificando o fator de iniciação da tradução mitocondrial 3(Tabela 1)8. Os produtos de tradução mitocondrial foram rotulados radioativamente e separados em SDS-PAAG9. As amostras foram coletadas a cada 2,5 minutos antes da saturação para a con…

Discussion

Investigações de expressão genética ocupam uma parte central nas ciências da vida moderna. Inúmeros métodos que fornecem insights sobre esse processo complexo foram desenvolvidos. Aqui, descrevemos o método que permite acessar a biossíntese proteica na levedura s. cerevisiae mitocôndrias. Geralmente é aplicado para comparar a eficiência de tradução dos mRNAs em mitocôndrias de levedura mutante versus tipo selvagem para acessar as consequências da mutação estudada. Este é um dos experimentos b?…

Materials

2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Bacteriological agar	Sigma-Aldrich	A5306
Biowave Cell Density Meter CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
BRAND standard disposable cuvettes	Sigma-Aldrich	Z330361
chloroform	Sigma-Aldrich	288306
cycloheximide	Sigma-Aldrich	C1988
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G5388
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
digital block heater	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Methionine, 500µCi (18.5MBq), Stabilized Aqueous Solution	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Eppendorf Centrifuge 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Storage Phosphor Screens	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625
methanol	Sigma-Aldrich	34860
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-Methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubator	New Brunswick Scientific
Peptone from meat, bacteriological	Millipore	91249
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P7626
Pierce 660nm Protein Assay Kit	Thermo Scientific	22662
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cell	Bio-Rad	1651802
Puromycin dihydrochloride from Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 phosphor imager	GE Healthcare
Trizma base	Sigma-Aldrich	93352
Vacuum Heated Gel Dryer	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1625