단일 난사 기자 분석기를 사용하여 체외 성숙 중 모성 mRNA 번역 프로그램 정의
Summary
이 프로토콜은 시험관 내 성숙 시 단일 난초에서 mRNA 번역의 조절을 연구하기 위해 기자 분석에 설명합니다.
Abstract
난수 핵 성숙과 관련된 사건은 잘 설명되어 있다. 그러나, 훨씬 적은 풍부하게 함의 풍부하게 하고 취득을 위한 준비에 있는 세포질에서 일어나는 분자 통로 및 프로세스에 관하여 알려져 있습니다. 난모성 성숙 도중, 유전자 발현의 변경은 전사보다는 모계 메신저 RNA (mRNA)의 번역 그리고 저하에 전적으로 달려 있습니다. 따라서 번역 프로그램의 실행은 배아 발달을 유지하기 위해 난소 세포 발달 역량을 확립하는 데 중요한 역할을합니다. 이 논문은 메이오틱 성숙 과 난소 – zygote 전환 에서 발생하는 모계 mRNA 번역의 프로그램을 정의하는 데 초점을 맞추고 있습니다. 이 방법 논문에서는 체외 내분피 성숙 중에 표적 mRNA의 번역 을 연구하는 전략이 제시됩니다. 여기서, Ypet 기자는 관심 있는 유전자의 3’un번역 영역(UTR)에 융합된 다음, 주입된 부피를 제어하기 위해 mCherry를 위한 폴리아데니얼mRNA 인코딩과 함께 난모세포에 마이크로 주입된다. 시간 경과 현미경 을 사용하여 기자 축적을 측정함으로써, 번역 속도는 난소 메이오틱 성숙 동안 다른 전환에서 계산됩니다. 여기서, 난소 분리 및 주입, 시간 경과 기록 및 데이터 분석을 위한 프로토콜이 Ypet/interleukin-7(IL-7)-3’UTR 리포터를 예로 들 수 있다.
Introduction
완전히 자란 포유류 난소세포는 토티포텐시의 수정 및 획득에 대비하여 급격한 변화를 겪습니다. 이러한 변화는 수정 후 배아 발달을 유지하는 데 필수적입니다. 핵 성숙과 관련된 사건은 비교적 잘 설명되어 있지만, 난모세포 세포질의 분자 과정과 경로에 대해 훨씬 적게 알려져 있습니다. 난모세포 성숙의 마지막 단계 동안, 난모세포는 전사적으로 침묵하며 유전자 발현은 mRNA 번역 및 분해1,2에전적으로 의존한다. 발달 능력에 중요한 단백질의 합성은, 그러므로, oocyte 성장1,3도중 이전에 합성된 장수 mRNA의 시간별 번역의 프로그램에 의존합니다. 메이오능 성숙 과 난소 -zygote 전환 중에 실행 된 모성 mRNA 번역의이 프로그램을 정의하는 초점의 일환으로,이 논문은 체외 메이오틱 성숙 동안 단일 oocytes에서 대상 모계 mRNAs의 번역의 활성화 및 억압을 연구하는 전략을 제시한다.
이 방법에서 YPet 오픈 판독 프레임은 관심 있는 성적증명서의 3′ UTR의 상류로 복제됩니다. 다음으로, mRNA는 주입된 볼륨을 제어하기 위해 mCherry를 코딩하는 폴리아데니얼mRNA와 함께 난모세포에 마이크로 주입된다. 리포터 축적은 시간 경과 현미경 검사를 사용하여 체외 수막 마이오틱 성숙 중에 측정됩니다. 황색 형광 단백질(YFP)과 mCherry의 축적은 개별 난소세포에 기록되며, YFP 신호는 공동 주입된 mCherry의 고원 수준에 의해 수정된다. 데이터 수집 후, 변환 속도는 곡선 피팅에 의해 얻어진 곡선의 경사를 계산하여 체외 우피 메이오틱 성숙 중에 다른 시간 간격으로 계산됩니다.
이 방법은 선택한 내생 성 mRNA의 번역 의 변화를 실험적으로 확인하는 도구를 제공합니다. 또한, 이 방법은 표적 mRNA4,5,6의3’UTR의 시스-규제 요소를 조작하여 난파성 메이오틱 성숙 시 번역을 제어하는 조절 요소의 특성화를 용이하게 한다. 폴리(A) 꼬리 길이를 조작하면 난모세포5에서아데닐라제/데아데닐라제 활동에 대한 통찰력을 허용한다. 시스 작용 원소 또는 RNA 면역 침전의 돌연변이 발생은 코그네이트 RNA 결합 단백질6,7과의상호 작용을 연구하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 이 방법은 오낭화 화질 감소와 관련된 모델에서 타겟 3’UTR 번역을 측정하여 난낭성 개발 능력에 중요한 번역 프로그램의 필수 구성 요소를 식별하는 데 사용할 수 있다 8,9,10. 이 방법 논문은 IL-7의 3’UTR에 융합된 Ypet 리포터와 함께 21일 된 C57/BL6 마우스의 디누드 난동구가 마이크로 주입된 대표적인 실험을 제시한다. 난구 주입, 시간 경과 기록 및 데이터 분석을 위한 설정 및 프로토콜이 설명되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 방법은 시험관 내 oocyte meiotic 성숙 도중 다른 전환에서 표적 mRNA의 번역의 활성화 그리고 억압을 공부하는 전략을 설명합니다. IL-7은 난낭구-적혈구 세포 통신8,13에관여할 수 있는 난모세포에 의해 방출된 사이토카인이 본 방법을 설명하기 위해 선택되었다. IL-7은 난마귀 성숙도 8 동안 점점 더 번역되는 것으로 알려져 있…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH R01 GM097165, GM116926 및 유니스 케네디 슈리버 NICHD 국립 재생 및 불임 P50 HD055764에서 마르코 콘티에 의해 지원되었다. 엔리코 M. 달델로는 랄로 재단의 펠로우십에 의해 지원되었고 나타자 G. J. 코스터만스는 네덜란드 과학 연구 기구 (NWO)의 루비콘 펠로우십에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
Riferimenti
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