Definition des Programms der mütterlichen mRNA-Translation während der In-vitro-Reifung mit einem Single Oocyte Reporter Assay
Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen Reporter-Assay zur Untersuchung der Regulation der mRNA-Translation in einzelnen Eizellen während der In-vitro-Reifung.
Abstract
Ereignisse, die mit der Kernreifung der Eizellen verbunden sind, wurden gut beschrieben. Viel weniger ist jedoch über die molekularen Wege und Prozesse bekannt, die im Zytoplasma in Vorbereitung auf die Befruchtung und den Erwerb von Totipotenz stattfinden. Während der Eizellreifung hängen Veränderungen der Genexpression ausschließlich von der Translation und dem Abbau mütterlicher Boten-RNAs (mRNAs) und nicht von der Transkription ab. Die Durchführung des translationalen Programms spielt daher eine Schlüsselrolle bei der Etablierung der Eizellentwicklungskompetenz zur Aufrechterhaltung der Embryonalentwicklung. Diese Arbeit ist Teil eines Schwerpunkts auf der Definition des Programms der mütterlichen mRNA-Translation, das während der meiotischen Reifung und am Übergang von Eizelle zu Zygote stattfindet. In diesem Methodenpapier wird eine Strategie vorgestellt, um die Regulation der Translation von Ziel-mRNAs während der In-vitro-Eizellreifung zu untersuchen. Hier wird ein Ypet-Reporter mit der 3′ unübersetzten Region (UTR) des interessierenden Gens verschmolzen und dann zusammen mit polyadenylierter mRNA, die für mCherry kodiert, um das injizierte Volumen zu kontrollieren, in die Eizellen mikroinjiziert. Durch die Verwendung der Zeitraffermikroskopie zur Messung der Reporterakkumulation werden die Translationsraten bei verschiedenen Übergängen während der meiotischen Reifung der Eizellen berechnet. Hier wurden die Protokolle für die Isolierung und Injektion von Eizellen, die Zeitrafferaufzeichnung und die Datenanalyse am Beispiel des UTR-Reporters ypet/interleukin-7 (IL-7)-3′ beschrieben.
Introduction
Eine ausgewachsene Eizelle eines Säugetiers erfährt schnelle Veränderungen in Vorbereitung auf die Befruchtung und den Erwerb von Totipotenz. Diese Veränderungen sind unerlässlich, um die embryonale Entwicklung nach der Befruchtung aufrechtzuerhalten. Obwohl die mit der Kernreifung verbundenen Ereignisse relativ gut beschrieben sind, ist viel weniger über die molekularen Prozesse und Wege im Zytoplasma der Eizelle bekannt. In den letzten Stadien der Eizellreifung sind die Eizellen transkriptionell still, und die Genexpression hängt vollständig von der mRNA-Translation und dem Abbau ab1,2. Die Synthese von Proteinen, die für die Entwicklungskompetenz entscheidend sind, beruht daher auf einem Programm der zeitgesteuerten Translation langlebiger mRNAs, die früher während des Eizellwachstumssynthetisiertwurden 1,3. Im Rahmen eines Schwerpunkts auf der Definition dieses Programms der mütterlichen mRNA-Translation, das während der meiotischen Reifung und am Übergang von Eizelle zu Zygote durchgeführt wird, wird in diesem Artikel eine Strategie zur Untersuchung der Aktivierung und Unterdrückung der Translation von mütterlichen Ziel-mRNAs in einzelnen Eizellen während der in vitro meiotischen Reifung präsentiert.
Bei dieser Methode wird der offene YPet-Leserahmen vor der 3′-UTR des interessierenden Transkripts geklont. Als nächstes werden mRNAs, die diesen Reporter kodieren, zusammen mit polyadenylierten mRNAs, die mCherry kodieren, in Eizellen mikroinjiziert, um das injizierte Volumen zu kontrollieren. Die Reporterakkumulation wird während der meiotischen Reifung von In-vitro-Eizellen mittels Zeitraffermikroskopie gemessen. Die Akkumulation von gelb fluoreszierendem Protein (YFP) und mCherry wird in einzelnen Eizellen aufgezeichnet, und YFP-Signale werden durch das plateauierte Niveau der co-injizierten mCherry korrigiert. Nach der Datenerfassung werden die Translationsraten für verschiedene Zeitintervalle während der meiotischen Reifung von In-vitro-Eizellen berechnet, indem die Steigung der Kurve berechnet wird, die durch Kurvenanpassung erhalten wird.
Dieser Ansatz bietet ein Werkzeug, um Veränderungen in der Translation ausgewählter endogener mRNAs experimentell zu bestätigen. Darüber hinaus erleichtert diese Methode die Charakterisierung regulatorischer Elemente, die die Translation während der meiotischen Reifung von Eizellen steuern, indem cis-regulatorische Elemente der 3′-UTR der Ziel-mRNAs4,5,6manipuliert werden. Die Manipulation der Poly(A)-Schwanzlänge ermöglicht auch den Einblick in die Adenylase/Deadenylase-Aktivität in Eizellen5. Mutagenese von cis-wirkenden Elementen oder RNA-Immunpräzipitation kann verwendet werden, um Wechselwirkungen mit verwandten RNA-bindenden Proteinen zu untersuchen6,7. Darüber hinaus kann diese Methode verwendet werden, um wesentliche Komponenten des Translationsprogramms zu identifizieren, die für die Entwicklungskompetenz der Eizellen entscheidend sind, indem die UTR-Translation von Ziel 3′ in Modellen gemessenwird,die mit einer verminderten Eizellqualität verbunden sind 8,9,10. Dieses Methodenpapier stellt ein repräsentatives Experiment vor, bei dem entblähte Eizellen von 21 Tage alten C57 / BL6-Mäusen mit einem Ypet-Reporter mikroinjiziert wurden, der mit der 3′ UTR von IL-7 verschmolzen ist. Das Setup und protokoll für die Eizellinjektion, die Zeitrafferaufzeichnung und die Datenanalyse wurden beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die vorgestellte Methode beschreibt eine Strategie zur Untersuchung der Aktivierung und Unterdrückung der Translation von Ziel-mRNA an verschiedenen Übergängen während der in vitro Oozytenmionischen Reifung. IL-7, ein von der Eizelle freigesetztes Zytokin, das an der Kommunikation zwischen Eizelle und Kumuluszell beteiligt sein kann8,13, wurde ausgewählt, um diese Methode zu beschreiben. Es ist bekannt, dass IL-7 während der Eizellreifung<sup class…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von NIH R01 GM097165, GM116926 und Eunice Kennedy Shriver NICHD National Centers for Translational Research in Reproduction and Infertility P50 HD055764 an Marco Conti unterstützt. Enrico M. Daldello wurde durch ein Stipendium der Lalor Foundation und Natasja G. J. Costermans durch ein Rubicon-Stipendium der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) unterstützt.
Materials
| Preparation of media | |||
| Bovine Serum Albumin Powder Bioxtra | Sigma-Aldrich | SIAL-A3311 | |
| Cilostamide | EMD Millipore | 231085 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M2645 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x Solution, Sterile Filtered | Genesee Scientific Corporation (GenClone) | 25-512 | |
| Sodium Bicarbonate | JT-Baker | 3506-1 | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Preparation of mRNA encoding YFP/3' UTR and mCherry | |||
| Agarose | Apex Biomedical | 20-102QD | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C1389-1G | |
| Choo-Choo Cloning Kit | McLab | CCK-20 | |
| CutSmart Buffer (10x) | New England Biolabs | B7204 | |
| DNA loading dye (6x) | Thermo Scientific | R0611 | |
| dNTP Solution | New England Biolabs | N0447S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176 | |
| GeneRuler 1 kb DNA ladder | Thermo Fisher | SM1333 | |
| LB Agar Plates with 100 µg/mL Carbenicillin, Teknova | Teknova | L1010 | |
| LB Medium (Capsules) | MP Biomedicals | 3002-021 | |
| MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Life Technologies | AM1908 | |
| MfeI-HF restriction enzyme | New England Biolabs | R3589 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1344 | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(A) Tailing kit | Invitrogen | AM1350 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| S.O.C. medium | Thermo Fisher | 15544034 | |
| TAE buffer | Apex Biomedical | 20-193 | |
| Ultrapure Ethidium Bromide Solution | Life Technologies | 15585011 | |
| Oocyte collection | |||
| Aspirator tube assembly for calibrated micro-pipettes | Sigma-Aldrich | A5177-5EA | |
| Calibrated micro-pipettes | Drummond Scientific Company | 2-000-025 | |
| PMSG- 5000 | Mybiosource | MBS142665 | |
| PrecisionGlide Needle 26 G x 1/2 | BD | 305111 | |
| Syringe 1 ml | BD | 309659 | |
| Oocyte micro-injection | |||
| 35 mm Dish | No. 0 Coverslip | 20 mm Glass Diameter | Uncoated | MatTek | P35G-0-20-C | For time-lapse microscopy |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument | BF100-78-10 | |
| Oil for Embryo Culture | Irvine Scientific | 9305 | |
| Petri Dish | Falcon | 351006 | For micro-injection |
| Tissue Culture Dish | Falcon | 353001 | For oocyte incubation |
| VacuTip Holding Capillary | Eppendorf | 5195000036 | |
| Software | |||
| Biorender | BioRender | Preparation of Figure 1S | |
| MetaMorph, version 7.8.13.0 | Molecular Devices | For time-lapse microscopy, analysis of 3' UTR translation |
Riferimenti
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