使用硫二甘酸（TGA）估计植物生物质木质素含量

Summary

在这里，我们提出了一个修改后的TGA方法，用于估计草本植物生物质中的木质素含量。这种方法通过与木质素形成特定的硫化物键来估计木质素含量，并且比克拉森方法具有优势，因为它需要相对较小的木质素含量估计样本。

Abstract

木质素是一种天然聚合物，是地球上仅次于纤维素的第二富足聚合物。木质素主要沉积在植物二级细胞壁中，是一种芳香异质体，主要由三种具有重要工业意义的单酚组成。木质素在植物生长发育中起着重要作用，在动物饲料、木材和工业木质素产品的质量方面具有重要的保护作用。准确估计木质素含量对于基本了解木质素生物合成和生物质的工业应用都至关重要。硫二甘油酸（TGA）方法是估算植物生物量中木质素总含量的高度可靠的方法。这种方法通过与木质素的苯酒精群形成硫化物来估计木质素的含量，这种醇组在碱性条件下是可溶性的，在酸性条件下不溶性。木质素总含量使用商业竹木质素生成的标准曲线进行估算。

Introduction

木质素是植物细胞壁的重要承重成分之一，也是地球上第二丰富的聚合物^1。从化学上讲，木质素是一种由高分子量复合酚类化合物组成的交联异质体，形成芳香聚合物的天然可再生来源，并合成生物材料^2、3。这种天然聚合物在植物生长、发育、生存、机械支持、细胞壁刚性、水运、矿物运输、耐食性、组织和器官发育、能量沉积以及生物和生物应力^{4、5、6、7}等方面起着重要作用。利格宁主要由三种不同的单酚组成：针叶醇、西纳皮尔和p-coumaryl酒精，它们来自苯丙酮通路^8，9。木质素的数量和单体的组成因植物种类、组织/器官类型和^{植物发育的}不同阶段而异。根据来源和单酚成分，木质素大致分为软木、硬木和草木质素。软木主要由95%的针叶醇和4%的p-coumaryl和1%的甲基醇组成。硬木有针叶醇和甲基醇的比例相等，而草木质素是由针叶醇，锡那皮尔和p-coumaryl酒精^11，12的不同比例组成。单体的组成至关重要，因为它决定了细胞壁的木质素强度、分解和降解，以及确定分子结构、分支和与其他多糖^13、14的交叉连接。

由于其成本低^、丰度高，在觅食、纺织业、造纸业以及生物乙醇、生物燃料和生物制品方面，木质素研究越来越受到^重视。各种化学方法（如乙酰溴化物、酸洗涤剂、克拉森和高锰酸盐氧化）以及仪器方法（如近红外（NIR）光谱、核磁共振（NMR）光谱和紫外线（UV）光谱仪）用于木质素定量^9、17。木质素的分析方法一般根据电磁辐射、重力和溶解度进行分类。电磁辐射对木质素的估计原理是基于木质素的化学特性，木质素吸收特定波长的光。这些结果的估计依据是，木质素比碳水化合物具有更强的紫外线吸收性。1962年，博尔克和萨默维尔使用氯化钾颗粒来估计木材^中的木质素含量。然而，由于存在非木质素酚类化合物，且缺乏适当的灭绝系数，这种方法在草本样品中木质素含量的估计存在缺陷。1970年，弗格斯和戈林发现瓜亚西尔和注射器的复合吸收最大度为280纳米和270纳米，这纠正了博尔克和萨默维尔方法¹⁹的灭绝系数问题。后来，红外光谱学，一种高度敏感的表诺菌特征技术，也用于木质素估计与少量植物生物质样品。这种技术的一个例子是扩散反射傅立雅转换光谱仪。然而，这种方法缺乏一个类似于紫外线方法²⁰的适当标准。后来，NIRS（近红外光谱）和NMR（核磁共振光谱）估计了木质素含量。虽然这些方法有缺点，但它们不会改变木质素的化学结构，保持其纯度^20。

重度克拉森法是木质茎木质素估计的直接和最可靠的分析方法。重力木质素估计的基础是非木质化合物的水解/溶解和重力²¹不溶性木质素的收集。在这种方法中，通过浓缩H₂SO₄对生物量进行水解，提取木质素残留物^{20、22。。}这种方法估计的木质素含量称为酸不溶性木质素或克拉森木质素。克拉森方法的应用取决于植物种类、组织类型和细胞壁类型。单宁、多糖和蛋白质等非木质素成分的可变量存在，导致酸不溶性/可溶性木质素含量的估计存在成比例差异。因此，只建议采用克拉森法，用于木质素对木质茎等高木质物质含量生物量的估计^。溶解性方法，如乙酰溴化物（AcBr）、酸不溶性木质素和硫二甘醇酸（TGA），是估计各种植物生物质来源木质素含量的最常用方法。Kim等人建立了两种通过溶解提取木质素的方法。第一种方法通过溶解纤维素和半纤维素提取木质素作为不溶性残留物，而第二种方法将木质素分离在可溶性部分，将纤维素和血细胞素作为不溶性残留物^24。

在木质素估计中采用的类似方法基于溶解性是硫二甲酸 （TGA） 和乙酰溴化物 （AcBr） 方法²⁵.TGA和乙酰溴化物方法均通过测量溶解木质素在280纳米的吸收量来估计木质素含量：然而，AcBr方法在木质素溶解过程中降解木兰，并显示木质素含量²⁶的虚假增加。硫二甲酸酯 （TGA） 方法是更可靠的方法，因为它取决于与木质素的苯甲酸酯醇组与 TGA 的具体结合。TGA结合木质素是在酸性条件下使用HCl沉淀的，木质素的吸收量估计为280nm^27。TGA 方法具有结构修饰较少、木质素估计可溶性、非木质素成分干扰少以及与 TGA 特定结合导致木质素精确估计等额外优点。

这种TGA方法是根据用于木质素含量估算的植物生物质样品的种类进行修改的。在这里，我们修改和调整了快速TGA方法的稻草²⁷棉花组织估计木质素含量。简言之，干粉植物样品经过蛋白质溶解缓冲和甲醇提取，以去除蛋白质和酒精可溶性成分。酒精不溶性残留物在酸性条件下用TGA和沉淀木质素处理。使用商业竹木质素生成木质素标准曲线，并获得回归线（y = mx+c）。”x”值使用280纳米的木质素平均吸收值，而”m”和”c”值则从回归线输入，以计算棉花植物生物质样品中未知的木质素浓度。该方法分为五个阶段：1）植物样品的制备：2） 用水和甲醇清洗样品：3） 用TGA和酸处理颗粒，沉淀木质素：4） 木质素降水：和 5） 样品的标准曲线制备和木质素含量估算。前两个阶段主要侧重于植物材料制备，其次是水、PSB（蛋白质溶解缓冲器）和甲醇提取，以获得酒精不溶性材料。然后，它与TGA（硫二甘油酸）和HCl一起在第三阶段形成木质素复合物。最后，HCl被用来沉淀木质素，木质素溶解在氢氧化钠中，以测量其吸收量在280纳米^28。

Protocol

1. 植物样本的制备 从温室收集两个月大的棉花植物（图1A）。 通过松开植物周围的土壤（图1B），轻轻翻转植物盆，将土壤和根部与完整的横向根分开。 将收集的植物彻底清洗在装满水的托盘中，以清除所有污垢（用于根部样本）（图1C）。 使用纸巾干燥分离的根、茎和叶组织，并贴上标签（<strong …

Representative Results

比较了两条不同的棉花实验线，以弥补不同组织中木质素含量的差异。每个样本提取的木质素含量测量为280纳米，并记录其各自的吸收值。将每个生物复制品的平均吸收值与木质素标准曲线的回归线（表2，图3C）进行比较。回归线，y = mx + c，用于计算提取实验线、样本1和样品2的未知木质素含量。平均OD值的结果被替换在”x”中，而”m”和”c”值则从木质素标准曲线的…

Discussion

木质素在植物生长发育中起着重要作用，最近已广泛研究生物燃料、生物能源和生物制品的应用。木质素富含芳香化合物，储存在所有血管植物的二级细胞壁中。它具有多种工业应用，如木板产品，生物分散剂，絮凝剂，聚氨酯泡沫和在电路板^29，30，31的脂。大部分来自纸张和纸浆行业的木质素被作为废物释放或燃烧用于热生…

Materials

BioSpectrophotometer kinetic	Eppendorf kinetic	6136000010	For measuring absorbance at 280 nm
Centrifuge	Eppendorf	5424	For centrifuging  samples
Commercial bamboo lignin	Aldrich	1002171289	Used in the preparation of the standard curve
Distilled water	Fischer Scientific	16690382	Used in the protocol
Falcon tubes	VWR	734-0448	Containers for solutions
Freezer mill	Spex Sample Prep	68-701-15	For fine grinding of plant tissue samples
Heat block/ Thermal mixer	Eppendorf	13527550	For temperature controlled steps during lignin extraction
Hotplate stirrer	Walter	WP1007-HS	Used for preparation of solutions
Hydrochloric acid (HCL)	Sigma	221677	Used in the protocol
Incubator	Fisherbrand	150152633	For thorough drying of plant tissue samples
Measuring scale	Mettler toledo	30243386	For measuring plant tissue weight, standards and microfuge tubes
Methanol (100 %)	Fischer Scientific	67-56-1	Used in the protocol
Microfuge tubes (2 mL)	Microcentrifuge	Z628034-500EA	Containers for extraction of lignin
Plant biomass gerinder	Hanchen	Amazon	Used for crushing dried samples
pH meter	Fisher Scientific	AE150	Measuring pH for solutions prepared for lignin extraction
Temperature controlled incubator/oven	Fisher Scientific	15-015-2633	Used in the protocol
Thioglycolic acid (TGA)	Sigma Aldrich	68-11-1	Used in the protocol
Vacuum dryer	Eppendorf	22820001	Used for drying samples
Vortex mixer	Eppendorf	3340001	For proper mixing of samples