Tinción de inmunofluorescencia de montaje completo, imágenes confocales y reconstrucción 3D del nódulo sinoauricular y auriculoventricular en el ratón
Summary
Proporcionamos un protocolo paso a paso para la tinción de inmunofluorescencia de montaje completo del nódulo sinoauricular (SAN) y el nódulo auriculoventricular (AVN) en corazones murinos.
Abstract
La señal eléctrica generada fisiológicamente por las células marcapasos en el nódulo sinoauricular (SAN) se conduce a través del sistema de conducción, que incluye el nódulo auriculoventricular (AVN), para permitir la excitación y contracción de todo el corazón. Cualquier disfunción de SAN o AVN resulta en arritmias, lo que indica su papel fundamental en la electrofisiología y la arritmogénesis. Los modelos de ratón son ampliamente utilizados en la investigación de arritmias, pero la investigación específica de SAN y AVN sigue siendo un desafío.
La RAS se encuentra en la unión de la crista terminal con la vena cava superior y la AVN se encuentra en el vértice del triángulo de Koch, formado por el orificio del seno coronario, el anillo tricúspide y el tendón de Todaro. Sin embargo, debido al pequeño tamaño, la visualización por histología convencional sigue siendo un desafío y no permite el estudio de SAN y AVN dentro de su entorno 3D.
Aquí describimos un enfoque de inmunofluorescencia de montaje completo que permite la visualización local de SAN y AVN de ratón marcados. La tinción de inmunofluorescencia de montaje completo está diseñada para secciones más pequeñas de tejido sin necesidad de seccionamiento manual. Para este propósito, se disecciona el corazón del ratón, se elimina el tejido no deseado, seguido de fijación, permeabilización y bloqueo. Las células del sistema de conducción dentro de SAN y AVN se tiñen con un anticuerpo anti-HCN4. La microscopía de barrido láser confocal y el procesamiento de imágenes permiten diferenciar entre las células ganglionares y los cardiomiocitos que funcionan, y localizar claramente SAN y AVN. Además, se pueden combinar anticuerpos adicionales para etiquetar otros tipos de células, como las fibras nerviosas.
En comparación con la inmunohistología convencional, la tinción de inmunofluorescencia de montaje completo preserva la integridad anatómica del sistema de conducción cardíaca, lo que permite la investigación de AVN; especialmente en su anatomía e interacciones con el miocardio circundante y las células no miocitarias.
Introduction
Las arritmias son enfermedades comunes que afectan a millones de personas y son la causa de una morbilidad y mortalidad significativas en todo el mundo. A pesar de los enormes avances en el tratamiento y la prevención, como el desarrollo de marcapasos cardíacos, el tratamiento de las arritmias sigue siendo un desafío, principalmente debido al conocimiento muy limitado sobre los mecanismos subyacentes de la enfermedad 1,2,3. Una mejor comprensión tanto de la electrofisiología normal como de la fisiopatología de las arritmias puede ayudar a desarrollar estrategias de tratamiento novedosas, innovadoras y causales en el futuro. Además, para estudiar exhaustivamente la arritmogénesis, es importante localizar y visualizar el sistema de conducción cardíaca específico en modelos animales como el ratón, ya que los ratones son ampliamente utilizados en la investigación electrofisiológica.
Las partes principales del sistema de conducción cardíaca son el nódulo sinoauricular (SAN), donde el impulso eléctrico se genera en células marcapasos especializadas, y el nódulo auriculoventricular (AVN), que es la única conexión eléctrica entre las aurículas y los ventrículos4. Siempre que se alteran las propiedades electrofisiológicas de la RAS y la AVN, pueden ocurrir arritmias como el síndrome del seno enfermo o el bloqueo auriculoventricular que pueden conducir a deterioro hemodinámico, síncope e incluso la muerte, y así subrayar el papel esencial de la RAS y la NVA en electrofisiología y arritmogénesis5.
Los estudios exhaustivos sobre SAN o AVN requieren una localización y visualización precisas de ambas estructuras, idealmente dentro de su entorno fisiológico. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño y ubicación dentro del miocardio de trabajo, sin establecer una estructura macroscópicamente visible clara, estudiar la anatomía y electrofisiología de SAN y AVN es un desafío. Los puntos de referencia anatómicos se pueden usar para identificar aproximadamente la región que contiene SAN y AVN 6,7,8. En resumen, la RAS se encuentra en la región intercava de la aurícula derecha adyacente a la crista terminal muscular (TC), la AVN se encuentra dentro del triángulo de Koch establecido por la válvula tricúspide, el ostium del seno coronario y el tendón de Todaro. Hasta ahora, estos puntos de referencia anatómicos se utilizaron principalmente para localizar, eliminar y luego estudiar SAN y AVN como estructuras individuales (por ejemplo, por histología convencional). Sin embargo, para comprender mejor la compleja electrofisiología de SAN y AVN (por ejemplo, los efectos reguladores de las células adyacentes del miocardio de trabajo), es necesario estudiar los sistemas de conducción dentro del entorno fisiológico 3D.
La tinción de inmunofluorescencia de montaje completo es un método que se utiliza para estudiar las estructuras anatómicas in situ , preservando la integridad del tejido circundante9. Aprovechando el software de microscopía confocal y análisis de imágenes, SAN y AVN se pueden visualizar con anticuerpos marcados con fluorescencia dirigidos a canales iónicos expresados específicamente en estas regiones.
El siguiente protocolo explica los pasos necesarios para realizar un método de tinción de montaje completo bien establecido para la localización y visualización de microscopios SAN y AVN. Específicamente, este protocolo describe cómo (1) localizar SAN y AVN por puntos de referencia anatómicos para preparar estas muestras para tinción y análisis de microscopía (2) realizar tinción de inmunofluorescencia de montaje completo de los marcadores de referencia HCN4 y Cx43 (3) para preparar muestras SAN y AVN para microscopía confocal (4) para realizar imágenes confocales de SAN y AVN. También describimos cómo se puede modificar este protocolo para incluir tinción adicional de miocardio circundante o células no miocitos que funcionan, como fibras nerviosas autónomas, lo que permite una investigación exhaustiva del sistema de conducción cardíaca dentro del corazón.
Protocol
Representative Results
Discussion
La anatomía cardíaca ha sido tradicionalmente estudiada utilizando secciones histológicas delgadas11. Sin embargo, estos métodos no preservan la estructura tridimensional del sistema de conducción y, por lo tanto, solo proporcionan información 2D. El protocolo de tinción de inmunofluorescencia de montaje completo descrito aquí permite superar estas limitaciones y se puede usar de forma rutinaria para imágenes SAN y AVN.
En comparación con los métodos estánda…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Becas de China (CSC, a R. Xia), el Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK; 81X2600255 a S. Clauss, 81Z0600206 a S. Kääb), la Fundación Corona (S199/10079/2019 a S. Clauss), el SFB 914 (proyecto Z01 a H. Ishikawa-Ankerhold y S. Massberg y proyecto A10 a C. Schulz), el ERA-NET sobre Enfermedades Cardiovasculares (ERA-CVD; 01KL1910 a S. Clauss) y la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (a S. Clauss). Los financiadores no tuvieron ningún papel en la preparación del manuscrito.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Altro | |||
| Plastic ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory | ||
Riferimenti
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