Coloration par immunofluorescence à monture entière, imagerie confocale et reconstruction 3D du nœud sino-auriculaire et auriculo-ventriculaire chez la souris
Summary
Nous fournissons un protocole étape par étape pour la coloration par immunofluorescence complète du nœud sino-auriculaire (SAN) et du nœud auriculo-ventriculaire (AVN) dans les cœurs murins.
Abstract
Le signal électrique physiologiquement généré par les cellules du stimulateur cardiaque dans le nœud sino-auriculaire (SAN) est conduit à travers le système de conduction, qui comprend le nœud auriculo-ventriculaire (AVN), pour permettre l’excitation et la contraction de tout le cœur. Tout dysfonctionnement du SAN ou de l’AVN entraîne des arythmies, indiquant leur rôle fondamental dans l’électrophysiologie et l’arythmogenèse. Les modèles murins sont largement utilisés dans la recherche sur l’arythmie, mais l’étude spécifique du SAN et de l’AVN reste difficile.
Le SAN est situé à la jonction de la crista terminalis avec la veine cave supérieure et AVN est situé au sommet du triangle de Koch, formé par l’orifice du sinus coronaire, l’anneau tricuspide et le tendon de Todaro. Cependant, en raison de la petite taille, la visualisation par histologie conventionnelle reste difficile et ne permet pas l’étude du SAN et de l’AVN dans leur environnement 3D.
Nous décrivons ici une approche d’immunofluorescence à montage entier qui permet la visualisation locale du SAN et de l’AVN marqués chez la souris. La coloration par immunofluorescence à montage entier est destinée à de plus petites sections de tissu sans nécessiter de section manuelle. À cette fin, le cœur de souris est disséqué, avec le tissu indésirable enlevé, suivi de la fixation, de la perméabilisation et du blocage. Les cellules du système de conduction dans le SAN et l’AVN sont ensuite colorées avec un anticorps anti-HCN4. La microscopie confocale à balayage laser et le traitement d’image permettent de différencier les cellules nodales et les cardiomyocytes fonctionnels, et de localiser clairement le SAN et l’AVN. En outre, des anticorps supplémentaires peuvent également être combinés pour marquer d’autres types de cellules, telles que les fibres nerveuses.
Par rapport à l’immunohistologie conventionnelle, la coloration par immunofluorescence à montage entier préserve l’intégrité anatomique du système de conduction cardiaque, permettant ainsi l’investigation de l’AVN; en particulier dans leur anatomie et leurs interactions avec le myocarde de travail environnant et les cellules non myocytaires.
Introduction
Les arythmies sont des maladies courantes qui touchent des millions de personnes et sont la cause d’une morbidité et d’une mortalité importantes dans le monde entier. Malgré d’énormes progrès dans le traitement et la prévention, tels que le développement de stimulateurs cardiaques, le traitement des arythmies reste difficile, principalement en raison des connaissances très limitées sur les mécanismes sous-jacents de la maladie 1,2,3. Une meilleure compréhension de l’électrophysiologie normale et de la physiopathologie des arythmies peut aider à développer des stratégies de traitement nouvelles, innovantes et causales à l’avenir. De plus, pour étudier de manière exhaustive l’arythmagénèse, il est important de localiser et de visualiser le système de conduction cardiaque spécifique dans des modèles animaux tels que la souris, car les souris sont largement utilisées dans la recherche en électrophysiologie.
Les principales parties du système de conduction cardiaque sont le nœud sino-auriculaire (SAN), où l’impulsion électrique est générée dans des cellules de stimulateur cardiaque spécialisées, et le nœud auriculo-ventriculaire (AVN), qui est la seule connexion électrique entre les oreillettes et les ventricules4. Chaque fois que les propriétés électrophysiologiques du SAN et de l’AVN sont altérées, des arythmies telles que le syndrome du sinus malade ou le bloc auriculo-ventriculaire peuvent survenir, ce qui peut entraîner une détérioration hémodynamique, une syncope et même la mort, soulignant ainsi le rôle essentiel du SAN et de l’AVN dans l’électrophysiologie et l’arythmogenèse5.
Des études approfondies sur SAN ou AVN nécessitent une localisation et une visualisation précises des deux structures, idéalement dans leur environnement physiologique. Cependant, en raison de leur petite taille et de leur emplacement dans le myocarde de travail, sans établir une structure macroscopiquement visible clairement, l’étude de l’anatomie et de l’électrophysiologie du SAN et de l’AVN est difficile. Les repères anatomiques peuvent être utilisés pour identifier approximativement la région qui contient SAN et AVN 6,7,8. En bref, SAN est situé dans la région inter-cavale de l’oreillette droite adjacente à la crista terminalis musculaire (CT), AVN est situé dans le triangle de Koch établi par la valve tricuspide, l’ostium du sinus coronaire et le tendon de Todaro. Jusqu’à présent, ces repères anatomiques ont été principalement utilisés pour localiser, supprimer puis étudier SAN et AVN en tant que structures individuelles (par exemple, par histologie conventionnelle). Pour mieux comprendre l’électrophysiologie complexe du SAN et de l’AVN (par exemple, les effets régulateurs des cellules adjacentes du myocarde de travail), il est toutefois nécessaire d’étudier les systèmes de conduction dans l’environnement physiologique 3D.
La coloration par immunofluorescence à montage entier est une méthode utilisée pour étudier les structures anatomiques in situ tout en préservant l’intégrité des tissus environnants9. Tirant parti des logiciels de microscopie confocale et d’analyse d’images, SAN et AVN peuvent être visualisés avec des anticorps marqués par fluorescence ciblant les canaux ioniques spécifiquement exprimés dans ces régions.
Le protocole suivant explique les étapes nécessaires pour effectuer une méthode de coloration à monture entière bien établie pour la localisation et la visualisation des microscopes SAN et AVN. Plus précisément, ce protocole décrit comment (1) localiser le SAN et l’AVN par repères anatomiques pour préparer ces échantillons pour la coloration et l’analyse microscopique (2) effectuer une coloration par immunofluorescence à montage entier des marqueurs de référence HCN4 et Cx43 (3) préparer les échantillons SAN et AVN pour la microscopie confocale (4) effectuer l’imagerie confocale du SAN et de l’AVN. Nous décrivons également comment ce protocole peut être modifié pour inclure une coloration supplémentaire du myocarde de travail environnant ou des cellules non myocytaires telles que les fibres nerveuses autonomes, ce qui permet une étude approfondie du système de conduction cardiaque dans le cœur.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’anatomie cardiaque a traditionnellement été étudiée à l’aide de coupes histologiques minces11. Cependant, ces méthodes ne préservent pas la structure tridimensionnelle du système de conduction et ne fournissent donc que des informations 2D. Le protocole de coloration par immunofluorescence à montage complet décrit ici permet de surmonter ces limitations et peut être utilisé en routine pour l’imagerie SAN et AVN.
Par rapport aux méthodes standard tel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le China Scholarship Council (CSC, à R. Xia), le Centre allemand de recherche cardiovasculaire (DZHK; 81X2600255 à S. Clauss, 81Z0600206 à S. Kääb), la Fondation Corona (S199/10079/2019 à S. Clauss), le SFB 914 (projet Z01 à H. Ishikawa-Ankerhold et S. Massberg et projet A10 à C. Schulz), l’ERA-NET sur les maladies cardiovasculaires (ERA-CVD; 01KL1910 à S. Clauss) et la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (à S. Clauss). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la préparation des manuscrits.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Altro | |||
| Plastic ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory | ||
Riferimenti
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