تلطيخ التألق المناعي بالكامل ، والتصوير البؤري وإعادة البناء 3D للعقدة الجيبية الأذينية والأذينية البطينية في الماوس
Summary
نحن نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة لتلطيخ التألق المناعي الكامل للعقدة الجيبية الأذينية (SAN) والعقدة الأذينية البطينية (AVN) في قلوب الفئران.
Abstract
يتم إجراء الإشارة الكهربائية التي تولدها خلايا جهاز تنظيم ضربات القلب في العقدة الجيبية الأذينية (SAN) من خلال نظام التوصيل ، والذي يتضمن العقدة الأذينية البطينية (AVN) ، للسماح بإثارة وتقلص القلب كله. أي خلل في SAN أو AVN يؤدي إلى عدم انتظام ضربات القلب ، مما يشير إلى دورهم الأساسي في الفيزيولوجيا الكهربية وعدم انتظام ضربات القلب. تستخدم نماذج الفئران على نطاق واسع في أبحاث عدم انتظام ضربات القلب ، لكن التحقيق المحدد في SAN و AVN لا يزال يمثل تحديا.
يقع SAN عند تقاطع محطة crista مع الوريد الأجوف العلوي ويقع AVN في قمة مثلث كوخ ، الذي يتكون من فتحة الجيب التاجي ، والحلقة ثلاثية الشرف ، ووتر تودارو. ومع ذلك ، نظرا لصغر حجمها ، لا يزال التصور بواسطة الأنسجة التقليدية يمثل تحديا ولا يسمح بدراسة SAN و AVN داخل بيئة 3D الخاصة بهم.
هنا نصف نهج التألق المناعي الكامل الذي يسمح بالتصور المحلي للماوس المسمى SAN و AVN. تم تصميم تلطيخ التألق المناعي بالكامل للأقسام الأصغر من الأنسجة دون الحاجة إلى التقسيم اليدوي. لهذا الغرض ، يتم تشريح قلب الفأر ، مع إزالة الأنسجة غير المرغوب فيها ، تليها التثبيت والنفاذية والحجب. ثم يتم تلطيخ خلايا نظام التوصيل داخل SAN و AVN بجسم مضاد ل HCN4. يسمح الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر ومعالجة الصور بالتمايز بين الخلايا العقدية وخلايا عضلة القلب العاملة ، وتحديد موقع SAN و AVN بوضوح. علاوة على ذلك ، يمكن دمج أجسام مضادة إضافية لتسمية أنواع الخلايا الأخرى أيضا ، مثل الألياف العصبية.
بالمقارنة مع الأنسجة المناعية التقليدية ، يحافظ تلطيخ التألق المناعي الكامل على السلامة التشريحية لنظام التوصيل القلبي ، مما يسمح بالتحقيق في التنخر اللاوعائي. خاصة في تشريحها وتفاعلاتها مع عضلة القلب العاملة المحيطة والخلايا غير العضلية.
Introduction
عدم انتظام ضربات القلب هي أمراض شائعة تؤثر على الملايين من الناس ، وهي سبب المراضة والوفيات الكبيرة في جميع أنحاء العالم. على الرغم من التقدم الهائل في العلاج والوقاية ، مثل تطوير أجهزة تنظيم ضربات القلب ، لا يزال علاج عدم انتظام ضربات القلب يمثل تحديا ، ويرجع ذلك أساسا إلى المعرفة المحدودة للغاية فيما يتعلق بآليات المرض الأساسية1،2،3. قد يساعد الفهم الأفضل لكل من الفيزيولوجيا الكهربية الطبيعية والفيزيولوجيا المرضية لعدم انتظام ضربات القلب في تطوير استراتيجيات علاج جديدة ومبتكرة وسببية في المستقبل. بالإضافة إلى ذلك ، لدراسة عدم انتظام ضربات القلب بشكل شامل ، من المهم توطين وتصور نظام التوصيل القلبي المحدد في النماذج الحيوانية مثل الفأر ، حيث تستخدم الفئران على نطاق واسع في أبحاث الفيزيولوجيا الكهربية.
الأجزاء الرئيسية لنظام التوصيل القلبي هي العقدة الجيبية الأذينية (SAN) ، حيث يتم توليد النبضة الكهربائية في خلايا جهاز تنظيم ضربات القلب المتخصصة ، والعقدة الأذينية البطينية (AVN) ، وهي الوصلة الكهربائية الوحيدة بين الأذينين والبطينين4. عندما يتم تغيير الخصائص الفيزيولوجية الكهربية ل SAN و AVN ، يمكن أن يحدث عدم انتظام ضربات القلب مثل متلازمة الجيوب الأنفية المريضة أو الكتلة الأذينية البطينية مما قد يؤدي إلى تدهور الدورة الدموية والإغماء وحتى الموت ، وبالتالي التأكيد على الدور الأساسي لكل من SAN و AVN في الفيزيولوجيا الكهربية وعدم انتظام ضربات القلب5.
تتطلب الدراسات الشاملة حول SAN أو AVN توطينا وتصورا دقيقا لكلا الهيكلين ، من الناحية المثالية داخل بيئتهما الفسيولوجية. ومع ذلك ، نظرا لصغر حجمها وموقعها داخل عضلة القلب العاملة ، دون إنشاء بنية واضحة مرئية مجهريا ، فإن دراسة علم التشريح والفيزيولوجيا الكهربية ل SAN و AVN أمر صعب. يمكن استخدام المعالم التشريحية لتحديد المنطقة التي تحتوي على SAN و AVN6،7،8 تقريبا. باختصار ، يقع SAN في المنطقة بين الأجوف من الأذين الأيمن المجاور لمحطة crista العضلية (CT) ، ويقع AVN داخل مثلث كوخ الذي أنشأه الصمام ثلاثي الشرف ، وعظم الجيب التاجي ووتر تودارو. حتى الآن ، تم استخدام هذه المعالم التشريحية بشكل أساسي لتحديد وإزالة ثم دراسة SAN و AVN كهياكل فردية (على سبيل المثال ، بواسطة الأنسجة التقليدية). لفهم أفضل الفيزيولوجيا الكهربية المعقدة ل SAN و AVN (على سبيل المثال ، التأثيرات التنظيمية للخلايا المجاورة لعضلة القلب العاملة) ، ومع ذلك ، من الضروري دراسة أنظمة التوصيل داخل بيئة 3D الفسيولوجية.
تلطيخ التألق المناعي الكامل هو طريقة تستخدم لدراسة الهياكل التشريحية في الموقع مع الحفاظ على سلامة الأنسجة المحيطة9. من خلال الاستفادة من الفحص المجهري متحد البؤر وبرنامج تحليل الصور ، يمكن تصور SAN و AVN باستخدام أجسام مضادة موسومة بالفلورسنت تستهدف القنوات الأيونية المعبر عنها بشكل خاص في هذه المناطق.
يشرح هذا البروتوكول التالي الخطوات اللازمة لتنفيذ طريقة تلطيخ مثبتة بالكامل راسخة لتوطين مجهر SAN و AVN وتصوره. على وجه التحديد ، يصف هذا البروتوكول كيفية (1) توطين SAN و AVN بواسطة المعالم التشريحية لإعداد هذه العينات للتلوين والتحليل المجهري (2) لإجراء تلطيخ التألق المناعي بالكامل للعلامات المرجعية HCN4 و Cx43 (3) لإعداد عينات SAN و AVN للفحص المجهري متحد البؤر (4) لإجراء تصوير متحد البؤر ل SAN و AVN. كما نصف كيف يمكن تعديل هذا البروتوكول ليشمل تلطيخا إضافيا لعضلة القلب العاملة المحيطة أو الخلايا غير العضلية مثل الألياف العصبية المستقلة التي تسمح بإجراء فحص شامل لنظام التوصيل القلبي داخل القلب.
Protocol
Representative Results
Discussion
تمت دراسة تشريح القلب تقليديا باستخدام أقسام نسيجية رقيقة11. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق لا تحافظ على الهيكل ثلاثي الأبعاد لنظام التوصيل ، وبالتالي ، توفر فقط معلومات 2D. يسمح بروتوكول تلطيخ التألق المناعي الكامل الموصوف هنا بالتغلب على هذه القيود ويمكن استخدامه بشكل روتيني لتصوير…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني (CSC ، إلى R. Xia) ، والمركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية (DZHK ؛ 81X2600255 إلى S. Clauss ، 81Z0600206 إلى S. Kääb) ، مؤسسة كورونا (S199 / 10079/2019 إلى S. Clauss) ، SFB 914 (مشروع Z01 إلى H. Ishikawa-Ankerhold و S. Massberg والمشروع A10 إلى C. Schulz) ، ERA-NET حول أمراض القلب والأوعية الدموية (ERA-CVD ؛ 01KL1910 إلى S. Clauss) و Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (إلى S. Clauss). لم يكن للممولين أي دور في إعداد المخطوطات.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Altro | |||
| Plastic ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory | ||
Riferimenti
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374 (2020).
- Schuttler, D., et al. Animal Models of Atrial Fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L. Bradyarrhythmias and Conduction Blocks. Revista Española de Cardiología (English Edition. 65 (7), 656-667 (2012).
- Wen, Y., Li, B. Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).
- Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).
- Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).
- Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).
- Muller-Taubenberger, A. Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies. Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).
- Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C., Eichinger, L., Rivero, F. . Dictyostelium discoideum Protocol. , 93-112 (2013).
- Shaw, P. J., Pawley, J. B. . Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 453-467 (2006).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
- Rysevaite, K., et al. Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node. Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).
- Mesirca, P., et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of ‘funny’ (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation. Nature Communication. 5, 4664 (2014).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Verheule, S., Kaese, S. Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models. Frontiers in Pharmacology. 4, 81 (2013).
- van der Velden, H. Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets. Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).
