نحن نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة لتلطيخ التألق المناعي الكامل للعقدة الجيبية الأذينية (SAN) والعقدة الأذينية البطينية (AVN) في قلوب الفئران.
يتم إجراء الإشارة الكهربائية التي تولدها خلايا جهاز تنظيم ضربات القلب في العقدة الجيبية الأذينية (SAN) من خلال نظام التوصيل ، والذي يتضمن العقدة الأذينية البطينية (AVN) ، للسماح بإثارة وتقلص القلب كله. أي خلل في SAN أو AVN يؤدي إلى عدم انتظام ضربات القلب ، مما يشير إلى دورهم الأساسي في الفيزيولوجيا الكهربية وعدم انتظام ضربات القلب. تستخدم نماذج الفئران على نطاق واسع في أبحاث عدم انتظام ضربات القلب ، لكن التحقيق المحدد في SAN و AVN لا يزال يمثل تحديا.
يقع SAN عند تقاطع محطة crista مع الوريد الأجوف العلوي ويقع AVN في قمة مثلث كوخ ، الذي يتكون من فتحة الجيب التاجي ، والحلقة ثلاثية الشرف ، ووتر تودارو. ومع ذلك ، نظرا لصغر حجمها ، لا يزال التصور بواسطة الأنسجة التقليدية يمثل تحديا ولا يسمح بدراسة SAN و AVN داخل بيئة 3D الخاصة بهم.
هنا نصف نهج التألق المناعي الكامل الذي يسمح بالتصور المحلي للماوس المسمى SAN و AVN. تم تصميم تلطيخ التألق المناعي بالكامل للأقسام الأصغر من الأنسجة دون الحاجة إلى التقسيم اليدوي. لهذا الغرض ، يتم تشريح قلب الفأر ، مع إزالة الأنسجة غير المرغوب فيها ، تليها التثبيت والنفاذية والحجب. ثم يتم تلطيخ خلايا نظام التوصيل داخل SAN و AVN بجسم مضاد ل HCN4. يسمح الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر ومعالجة الصور بالتمايز بين الخلايا العقدية وخلايا عضلة القلب العاملة ، وتحديد موقع SAN و AVN بوضوح. علاوة على ذلك ، يمكن دمج أجسام مضادة إضافية لتسمية أنواع الخلايا الأخرى أيضا ، مثل الألياف العصبية.
بالمقارنة مع الأنسجة المناعية التقليدية ، يحافظ تلطيخ التألق المناعي الكامل على السلامة التشريحية لنظام التوصيل القلبي ، مما يسمح بالتحقيق في التنخر اللاوعائي. خاصة في تشريحها وتفاعلاتها مع عضلة القلب العاملة المحيطة والخلايا غير العضلية.
عدم انتظام ضربات القلب هي أمراض شائعة تؤثر على الملايين من الناس ، وهي سبب المراضة والوفيات الكبيرة في جميع أنحاء العالم. على الرغم من التقدم الهائل في العلاج والوقاية ، مثل تطوير أجهزة تنظيم ضربات القلب ، لا يزال علاج عدم انتظام ضربات القلب يمثل تحديا ، ويرجع ذلك أساسا إلى المعرفة المحدودة للغاية فيما يتعلق بآليات المرض الأساسية1،2،3. قد يساعد الفهم الأفضل لكل من الفيزيولوجيا الكهربية الطبيعية والفيزيولوجيا المرضية لعدم انتظام ضربات القلب في تطوير استراتيجيات علاج جديدة ومبتكرة وسببية في المستقبل. بالإضافة إلى ذلك ، لدراسة عدم انتظام ضربات القلب بشكل شامل ، من المهم توطين وتصور نظام التوصيل القلبي المحدد في النماذج الحيوانية مثل الفأر ، حيث تستخدم الفئران على نطاق واسع في أبحاث الفيزيولوجيا الكهربية.
الأجزاء الرئيسية لنظام التوصيل القلبي هي العقدة الجيبية الأذينية (SAN) ، حيث يتم توليد النبضة الكهربائية في خلايا جهاز تنظيم ضربات القلب المتخصصة ، والعقدة الأذينية البطينية (AVN) ، وهي الوصلة الكهربائية الوحيدة بين الأذينين والبطينين4. عندما يتم تغيير الخصائص الفيزيولوجية الكهربية ل SAN و AVN ، يمكن أن يحدث عدم انتظام ضربات القلب مثل متلازمة الجيوب الأنفية المريضة أو الكتلة الأذينية البطينية مما قد يؤدي إلى تدهور الدورة الدموية والإغماء وحتى الموت ، وبالتالي التأكيد على الدور الأساسي لكل من SAN و AVN في الفيزيولوجيا الكهربية وعدم انتظام ضربات القلب5.
تتطلب الدراسات الشاملة حول SAN أو AVN توطينا وتصورا دقيقا لكلا الهيكلين ، من الناحية المثالية داخل بيئتهما الفسيولوجية. ومع ذلك ، نظرا لصغر حجمها وموقعها داخل عضلة القلب العاملة ، دون إنشاء بنية واضحة مرئية مجهريا ، فإن دراسة علم التشريح والفيزيولوجيا الكهربية ل SAN و AVN أمر صعب. يمكن استخدام المعالم التشريحية لتحديد المنطقة التي تحتوي على SAN و AVN6،7،8 تقريبا. باختصار ، يقع SAN في المنطقة بين الأجوف من الأذين الأيمن المجاور لمحطة crista العضلية (CT) ، ويقع AVN داخل مثلث كوخ الذي أنشأه الصمام ثلاثي الشرف ، وعظم الجيب التاجي ووتر تودارو. حتى الآن ، تم استخدام هذه المعالم التشريحية بشكل أساسي لتحديد وإزالة ثم دراسة SAN و AVN كهياكل فردية (على سبيل المثال ، بواسطة الأنسجة التقليدية). لفهم أفضل الفيزيولوجيا الكهربية المعقدة ل SAN و AVN (على سبيل المثال ، التأثيرات التنظيمية للخلايا المجاورة لعضلة القلب العاملة) ، ومع ذلك ، من الضروري دراسة أنظمة التوصيل داخل بيئة 3D الفسيولوجية.
تلطيخ التألق المناعي الكامل هو طريقة تستخدم لدراسة الهياكل التشريحية في الموقع مع الحفاظ على سلامة الأنسجة المحيطة9. من خلال الاستفادة من الفحص المجهري متحد البؤر وبرنامج تحليل الصور ، يمكن تصور SAN و AVN باستخدام أجسام مضادة موسومة بالفلورسنت تستهدف القنوات الأيونية المعبر عنها بشكل خاص في هذه المناطق.
يشرح هذا البروتوكول التالي الخطوات اللازمة لتنفيذ طريقة تلطيخ مثبتة بالكامل راسخة لتوطين مجهر SAN و AVN وتصوره. على وجه التحديد ، يصف هذا البروتوكول كيفية (1) توطين SAN و AVN بواسطة المعالم التشريحية لإعداد هذه العينات للتلوين والتحليل المجهري (2) لإجراء تلطيخ التألق المناعي بالكامل للعلامات المرجعية HCN4 و Cx43 (3) لإعداد عينات SAN و AVN للفحص المجهري متحد البؤر (4) لإجراء تصوير متحد البؤر ل SAN و AVN. كما نصف كيف يمكن تعديل هذا البروتوكول ليشمل تلطيخا إضافيا لعضلة القلب العاملة المحيطة أو الخلايا غير العضلية مثل الألياف العصبية المستقلة التي تسمح بإجراء فحص شامل لنظام التوصيل القلبي داخل القلب.
تمت دراسة تشريح القلب تقليديا باستخدام أقسام نسيجية رقيقة11. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق لا تحافظ على الهيكل ثلاثي الأبعاد لنظام التوصيل ، وبالتالي ، توفر فقط معلومات 2D. يسمح بروتوكول تلطيخ التألق المناعي الكامل الموصوف هنا بالتغلب على هذه القيود ويمكن استخدامه بشكل روتيني لتصوير…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني (CSC ، إلى R. Xia) ، والمركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية (DZHK ؛ 81X2600255 إلى S. Clauss ، 81Z0600206 إلى S. Kääb) ، مؤسسة كورونا (S199 / 10079/2019 إلى S. Clauss) ، SFB 914 (مشروع Z01 إلى H. Ishikawa-Ankerhold و S. Massberg والمشروع A10 إلى C. Schulz) ، ERA-NET حول أمراض القلب والأوعية الدموية (ERA-CVD ؛ 01KL1910 إلى S. Clauss) و Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (إلى S. Clauss). لم يكن للممولين أي دور في إعداد المخطوطات.
Anesthesia | |||
Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
In vivo instrumentation | |||
Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
General lab instruments | |||
Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
Microscopes | |||
Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
Software | |||
Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
General Lab Material | |||
0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
Chemicals | |||
0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
Agarose | Biozym | 850070 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
Drugs | |||
Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
Antibodies | |||
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
Altro | |||
Plastic ring | Self-designed and 3D printed | ||
Plasticine | Cernit | 49655005 | |
Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
Animals | |||
Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory |