Whole-Mount Immunfluoreszenz-Färbung, konfokale Bildgebung und 3D-Rekonstruktion des sinus- und atrioventrikulären Knotens in der Maus
Summary
Wir bieten ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung des Sinusknotens (SAN) und des atrioventrikulären Knotens (AVN) in murinen Herzen.
Abstract
Das elektrische Signal, das physiologisch von Schrittmacherzellen im Sinusknoten (SAN) erzeugt wird, wird durch das Reizleitungssystem geleitet, zu dem auch der atrioventrikuläre Knoten (AVN) gehört, um die Erregung und Kontraktion des gesamten Herzens zu ermöglichen. Jede Dysfunktion von SAN oder AVN führt zu Arrhythmien, was auf ihre grundlegende Rolle in der Elektrophysiologie und Arrhythmogenese hinweist. Mausmodelle werden häufig in der Arrhythmieforschung eingesetzt, aber die spezifische Untersuchung von SAN und AVN bleibt eine Herausforderung.
Das SAN befindet sich an der Kreuzung der Crista terminalis mit der oberen Hohlvene und AVN befindet sich an der Spitze des Koch-Dreiecks, das von der Öffnung des Koronarsinus, dem Trikuspidalring und der Sehne von Todaro gebildet wird. Aufgrund der geringen Größe bleibt die Visualisierung durch konventionelle Histologie jedoch eine Herausforderung und ermöglicht nicht die Untersuchung von SAN und AVN in ihrer 3D-Umgebung.
Hier beschreiben wir einen Whole-Mount-Immunfluoreszenz-Ansatz, der die lokale Visualisierung von markierten Maus-SAN und AVN ermöglicht. Die Whole-Mount-Immunfluoreszenz-Färbung ist für kleinere Gewebeabschnitte vorgesehen, ohne dass ein manuelles Schneiden erforderlich ist. Zu diesem Zweck wird das Mausherz präpariert, unerwünschtes Gewebe entfernt, gefolgt von Fixierung, Permeabilisierung und Blockierung. Zellen des Leitungssystems innerhalb von SAN und AVN werden dann mit einem Anti-HCN4-Antikörper gefärbt. Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie und Bildverarbeitung ermöglichen die Differenzierung zwischen Knotenzellen und arbeitenden Kardiomyozyten sowie die eindeutige Lokalisierung von SAN und AVN. Darüber hinaus können zusätzliche Antikörper kombiniert werden, um auch andere Zelltypen, wie z.B. Nervenfasern, zu markieren.
Im Vergleich zur konventionellen Immunhistologie bewahrt die Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung die anatomische Integrität des Herzleitungssystems und ermöglicht so die Untersuchung von AVN; Dies gilt insbesondere für ihre Anatomie und die Wechselwirkungen mit den umgebenden Myokard- und Nicht-Myozytenzellen.
Introduction
Arrhythmien sind häufige Erkrankungen, von denen Millionen von Menschen betroffen sind, und sie sind weltweit die Ursache für eine signifikante Morbidität und Mortalität. Trotz enormer Fortschritte in der Behandlung und Prävention, wie z.B. der Entwicklung von Herzschrittmachern, bleibt die Behandlung von Herzrhythmusstörungen eine Herausforderung, vor allem aufgrund des sehr begrenzten Wissens über die zugrunde liegenden Krankheitsmechanismen 1,2,3. Ein besseres Verständnis sowohl der normalen Elektrophysiologie als auch der Pathophysiologie von Arrhythmien könnte helfen, in Zukunft neuartige, innovative und kausale Behandlungsstrategien zu entwickeln. Um die Arrhythmogenese umfassend zu untersuchen, ist es außerdem wichtig, das spezifische Herzleitungssystem in Tiermodellen wie der Maus zu lokalisieren und zu visualisieren, da Mäuse in der elektrophysiologischen Forschung weit verbreitet sind.
Die Hauptbestandteile des Herzleitungssystems sind der Sinusknoten (SAN), in dem der elektrische Impuls in spezialisierten Schrittmacherzellen erzeugt wird, und der atrioventrikuläre Knoten (AVN), der die einzige elektrische Verbindung zwischen den Vorhöfen und den Ventrikeln darstellt4. Wann immer die elektrophysiologischen Eigenschaften von SAN und AVN verändert werden, können Arrhythmien wie das Sick-Sinus-Syndrom oder die atrioventrikuläre Blockade auftreten, die zu einer hämodynamischen Verschlechterung, Synkope und sogar zum Tod führen können und somit die wesentliche Rolle von SAN und AVN in der Elektrophysiologie und Arrhythmogenese unterstreichen5.
Umfassende Untersuchungen zu SAN oder AVN erfordern eine präzise Lokalisierung und Visualisierung beider Strukturen, idealerweise innerhalb ihrer physiologischen Umgebung. Aufgrund ihrer geringen Größe und Lage innerhalb des Arbeitsmyokards, ohne eine klare, makroskopisch sichtbare Struktur zu etablieren, ist es jedoch schwierig, die Anatomie und Elektrophysiologie von SAN und AVN zu untersuchen. Anatomische Landmarken können verwendet werden, um die Region, die SAN und AVN 6,7,8 enthält, grob zu identifizieren. Kurz gesagt, SAN befindet sich in der Kavallregion des rechten Vorhofs neben der Muskulatur Crista terminalis (CT), AVN befindet sich innerhalb des Dreiecks von Koch, das durch die Trikuspidalklappe, das Ostium der Koronarhöhle und die Sehne von Todaro gebildet wird. Bisher wurden diese anatomischen Orientierungspunkte hauptsächlich verwendet, um SAN und AVN als einzelne Strukturen zu lokalisieren, zu entfernen und dann zu untersuchen (z.B. durch konventionelle Histologie). Um die komplexe Elektrophysiologie von SAN und AVN besser zu verstehen (z.B. regulatorische Effekte benachbarter Zellen des arbeitenden Myokards), ist es jedoch notwendig, die Leitungssysteme innerhalb der physiologischen 3D-Umgebung zu untersuchen.
Die Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung ist eine Methode, die verwendet wird, um anatomische Strukturen in situ zu untersuchen und gleichzeitig die Integrität des umgebenden Gewebes zu erhalten9. Mit Hilfe von konfokaler Mikroskopie und Bildanalysesoftware können SAN und AVN mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern visualisiert werden, die auf Ionenkanäle abzielen, die spezifisch in diesen Regionen exprimiert werden.
In diesem Protokoll werden die notwendigen Schritte erläutert, um eine etablierte Whole-Mount-Färbemethode für die Lokalisierung und Visualisierung von SAN- und AVN-Mikroskopen durchzuführen. Insbesondere beschreibt dieses Protokoll, wie (1) SAN und AVN durch anatomische Orientierungspunkte lokalisiert werden, um diese Proben für die Färbung und Mikroskopieanalyse vorzubereiten, (2) eine Immunfluoreszenzfärbung der Referenzmarker HCN4 und Cx43 durchzuführen (3) SAN- und AVN-Proben für die konfokale Mikroskopie vorzubereiten (4) eine konfokale Bildgebung von SAN und AVN durchzuführen. Wir beschreiben auch, wie dieses Protokoll modifiziert werden kann, um eine zusätzliche Färbung von umgebenden Myokard- oder Nicht-Myozytenzellen wie autonomen Nervenfasern einzuschließen, was eine gründliche Untersuchung des Herzleitungssystems im Herzen ermöglicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Anatomie des Herzens wird traditionell anhand dünner histologischer Schnitte untersucht11. Diese Methoden bewahren jedoch nicht die dreidimensionale Struktur des Leitungssystems und liefern somit nur 2D-Informationen. Das hier beschriebene Whole-Mount-Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll ermöglicht es, diese Einschränkungen zu überwinden und kann routinemäßig für die SAN- und AVN-Bildgebung verwendet werden.
Im Vergleich zu Standardmethoden wie der konventionelle…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt vom China Scholarship Council (CSC, an R. Xia), dem Deutschen Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung (DZHK; 81X2600255 an S. Clauss, 81Z0600206 an S. Kääb), der Corona-Stiftung (S199/10079/2019 an S. Clauss), dem SFB 914 (Projekt Z01 an H. Ishikawa-Ankerhold und S. Massberg und Projekt A10 an C. Schulz), dem ERA-NET für kardiovaskuläre Erkrankungen (ERA-CVD; 01KL1910 an S. Clauss) und der Heinrich-und-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (an S. Clauss). Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Altro | |||
| Plastic ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory | ||
Riferimenti
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374 (2020).
- Schuttler, D., et al. Animal Models of Atrial Fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L. Bradyarrhythmias and Conduction Blocks. Revista Española de Cardiología (English Edition. 65 (7), 656-667 (2012).
- Wen, Y., Li, B. Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).
- Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).
- Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).
- Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).
- Muller-Taubenberger, A. Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies. Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).
- Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C., Eichinger, L., Rivero, F. . Dictyostelium discoideum Protocol. , 93-112 (2013).
- Shaw, P. J., Pawley, J. B. . Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 453-467 (2006).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
- Rysevaite, K., et al. Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node. Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).
- Mesirca, P., et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of ‘funny’ (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation. Nature Communication. 5, 4664 (2014).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Verheule, S., Kaese, S. Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models. Frontiers in Pharmacology. 4, 81 (2013).
- van der Velden, H. Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets. Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).
