전체 마운트 면역형광 염색, 컨포칼 이미징 및 마우스 내 동방방 및 방실 결절의 3D 재구성
Summary
우리는 쥐 심장에서 동방 결절 (SAN) 및 방실 결절 (AVN)의 전체 마운트 면역 형광 염색을위한 단계별 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
동방 결절 (SAN)의 심박 조율기 세포에 의해 생리 학적으로 생성 된 전기 신호는 방실 결절 (AVN)을 포함하는 전도 시스템을 통해 전도되어 전체 심장의 흥분과 수축을 허용합니다. SAN 또는 AVN의 기능 장애는 부정맥을 유발하여 전기 생리학 및 부정맥 발생에서 근본적인 역할을 나타냅니다. 마우스 모델은 부정맥 연구에 널리 사용되지만 SAN 및 AVN에 대한 구체적인 조사는 여전히 어렵습니다.
SAN은 상대 정맥과 크리스타 터미널의 교차점에 위치하고 AVN은 관상 동맥, 삼첨판 고리 및 Todaro의 힘줄의 구멍에 의해 형성된 Koch의 삼각형의 정점에 위치합니다. 그러나 크기가 작기 때문에 기존 조직학에 의한 시각화는 여전히 어렵고 3D 환경 내에서 SAN 및 AVN을 연구할 수 없습니다.
여기에서는 라벨링된 마우스 SAN 및 AVN의 로컬 시각화를 허용하는 전체 마운트 면역형광 접근법에 대해 설명합니다. 전체 마운트 면역형광 염색은 수동 절편이 필요 없는 조직의 더 작은 부분을 위한 것입니다. 이를 위해 마우스 심장을 해부하고 원치 않는 조직을 제거한 다음 고정, 투과 및 차단합니다. SAN 및 AVN 내의 전도 시스템의 세포는 항 -HCN4 항체로 염색됩니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 및 이미지 처리를 통해 결절 세포와 작동하는 심근 세포를 구별하고 SAN과 AVN을 명확하게 국소화할 수 있습니다. 또한, 추가 항체를 결합하여 신경 섬유와 같은 다른 세포 유형도 표지 할 수 있습니다.
기존의 면역 조직학과 비교하여 전체 마운트 면역 형광 염색은 심장 전도 시스템의 해부학 적 무결성을 보존하여 AVN을 조사 할 수 있습니다. 특히 해부학 적 구조와 주변의 작동하는 심근 및 비 근육 세포 세포와의 상호 작용에 대해서도 마찬가지입니다.
Introduction
부정맥은 수백만 명의 사람들에게 영향을 미치는 흔한 질병이며 전 세계적으로 심각한 이환율과 사망률의 원인입니다. 심장 박동기의 개발과 같은 치료 및 예방의 엄청난 발전에도 불구하고 부정맥 치료는 주로 근본적인 질병 메커니즘에 대한 지식이 매우 제한적이기 때문에 여전히 어렵습니다 1,2,3. 정상적인 전기 생리학과 부정맥의 병태생리학을 더 잘 이해하면 미래에 새롭고 혁신적이며 인과 관계가 있는 치료 전략을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 부정맥 발생을 종합적으로 연구하려면 마우스가 전기 생리학 연구에 널리 사용되기 때문에 마우스와 같은 동물 모델에서 특정 심장 전도 시스템을 국소화하고 시각화하는 것이 중요합니다.
심장 전도 시스템의 주요 부분은 특수 심박 조율기 세포에서 전기 충격이 생성되는 동방 결절 (SAN)과 심방과 심실 사이의 유일한 전기적 연결 인 방실 결절 (AVN)입니다4. SAN과 AVN의 전기 생리 학적 특성이 변경 될 때마다 아픈 부비동 증후군이나 방실 차단과 같은 부정맥이 발생하여 혈역학 적 악화, 실신 및 심지어 사망으로 이어질 수 있으므로 전기 생리학 및 부정맥 발생에서 SAN과 AVN의 필수적인 역할을 강조합니다5.
SAN 또는 AVN에 대한 포괄적인 연구에서는 두 구조의 정확한 위치 파악과 시각화가 필요하며, 이상적으로는 생리학적 환경 내에서 가능합니다. 그러나 작동하는 심근 내의 크기와 위치가 작기 때문에 명확한 거시적으로 보이는 구조를 설정하지 않고 SAN 및 AVN의 해부학 및 전기 생리학을 연구하는 것은 어렵습니다. 해부학적 랜드마크를 사용하여 SAN 및 AVN 6,7,8이 포함된 영역을 대략적으로 식별할 수 있습니다. 간단히 말해서, SAN은 근육 크리스타 터미널 (CT)에 인접한 우심방의 기병 간 영역에 위치하며, AVN은 삼첨판 막, 관상 동맥동의 ostium 및 Todaro의 힘줄에 의해 설정된 Koch의 삼각형 내에 위치합니다. 지금까지 이러한 해부학 적 랜드 마크는 주로 SAN 및 AVN을 개별 구조로 국소화, 제거 및 연구하는 데 사용되었습니다 (예 : 기존 조직학). 그러나 SAN 및 AVN의 복잡한 전기 생리학(예: 작동하는 심근의 인접 세포의 조절 효과)을 더 잘 이해하려면 생리학적 3D 환경 내에서 전도 시스템을 연구해야 합니다.
전체 마운트 면역 형광 염색은 주변 조직의 무결성을 유지하면서 현장에서 해부학 적 구조를 연구하는 데 사용되는 방법입니다9. 컨포칼 현미경 및 이미지 분석 소프트웨어를 활용하여 SAN 및 AVN은 이러한 영역에서 특이적으로 발현되는 이온 채널을 표적으로 하는 형광 표지된 항체로 시각화할 수 있습니다.
다음 프로토콜은 SAN 및 AVN 현미경 위치 파악 및 시각화를 위해 잘 정립된 전체 마운트 염색 방법을 수행하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 특히, 이 프로토콜은 (1) 염색 및 현미경 분석을 위해 이러한 샘플을 준비하기 위해 해부학적 랜드마크로 SAN 및 AVN을 국소화하는 방법 (2) 참조 마커 HCN4 및 Cx43의 전체 마운트 면역형광 염색을 수행하는 방법(3)을 설명하고, SAN 및 AVN의 컨포칼 이미징을 수행하기 위해 컨포칼 현미경을 위한 SAN 및 AVN 샘플을 준비합니다(4). 우리는 또한 심장 내의 심장 전도 시스템을 철저히 조사 할 수있는 자율 신경 섬유와 같은 주변 작동 심근 또는 비 근육 세포 세포의 추가 염색을 포함하도록이 프로토콜을 수정하는 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
심장 해부학은 전통적으로 얇은 조직 학적 섹션11을 사용하여 연구되었습니다. 그러나 이러한 방법은 전도 시스템의 3차원 구조를 보존하지 않으므로 2D 정보만 제공합니다. 여기에 설명된 전체 마운트 면역형광 염색 프로토콜을 사용하면 이러한 한계를 극복할 수 있으며 SAN 및 AVN 이미징에 일상적으로 사용할 수 있습니다.
파라핀 임베딩, 절편 및 항원 회수?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 장학위원회 (CSC, R. Xia), 독일 심혈관 연구 센터 (DZHK; 81X2600255에서 S. Clauss, 81Z0600206에서 S. Kääb), 코로나 재단 (S199 / 10079 / 2019에서 S. Clauss), SFB 914 (프로젝트 Z01에서 H. Ishikawa-Ankerhold 및 S. Massberg 및 프로젝트 A10에서 C. Schulz까지), 심혈관 질환에 관한 ERA-NET (ERA-CVD; 01KL1910에서 S. Clauss까지) 및 Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (S. Clauss에게). 기금 제공자는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Altro | |||
| Plastic ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory | ||
Riferimenti
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