Визуализация клеточной адаптации легких во время комбинированного озона и ЛПС-индуцированного острого повреждения легких
Summary
Комбинированные мыши, подвергшиеся воздействию озона и бактериального эндотоксина, демонстрируют широко распространенную гибель клеток, в том числе нейтрофилов. Мы наблюдали клеточные адаптации, такие как нарушение цитоскелетной ламеллиподии, повышенная клеточная экспрессия комплекса V АТФ-синтазы субъединиц β и ангиостатина в бронхо-альвеолярном лаваже, подавление иммунного ответа легких и задержка набора нейтрофилов.
Abstract
Легкие постоянно сталкиваются с прямыми и косвенными инсультами в виде стерильных (частицы или реактивные токсины) и инфекционных (бактериальных, вирусных или грибковых) воспалительных состояний. Подавляющая реакция хозяина может привести к скомпрометированному дыханию и острому повреждению легких, которое характеризуется рекрустацией нейтрофилов легких в результате пато-логического ответа хозяина на иммунную, коагулятивную и тканевую реакцию ремоделирования. Чувствительные микроскопические методы визуализации и количественной оценки клеточных адаптаций легких мыша в ответ на низкие дозы (0,05 ppm) озона, мощного загрязнителя окружающей среды в сочетании с бактериальным липополисахаридом, агонистом TLR4, имеют решающее значение для понимания воспалительных и восстановительных механизмов хозяина. Описан комплексный флуоресцентный микроскопический анализ различных легочных и системных компартментов тела, а именно бронхо-альвеолярной лаважной жидкости, перфузата сосудов легких, криосекций левого легкого и перфусата грудинного костного мозга. Показаны повреждения альвеолярных макрофагов, нейтрофилов, паренхималенной ткани легких, а также клеток костного мозга в корреляции с замедленным (до 36-72 ч) иммунным ответом, который характеризуется дискретными градиентами хемокина в анализируемых компартментах. Кроме того, представлены внеклеточные матриксы легких и клеточные цитоскелетные взаимодействия (актин, тубулин), митохондриальные и реактивные формы кислорода, антикоагулятивный плазминоген, его антиангиогенный пептидный фрагмент ангиостатин, субъединицы митохондриального АТФ-синтазы V, α и β. Эти суррогатные маркеры, когда они дополняются адекватными клеточными анализами in vitro и методами визуализации животных in vivo, такими как прижизальная микроскопия, могут предоставить жизненно важную информацию для понимания реакции легких на новые иммуномодулирующие агенты.
Introduction
Острое повреждение легких (АЛИ) является важнейшей патологической реакцией легких на инфекционные или другие вредные раздражители, которая характеризуется одновременной активацией коагулятивной, фибринолитической и врожденной иммуннойсистем1. Нейтрофилы быстро ощущают микробные, а также внутриклеточные повреждения через семейство Toll-подобных рецепторов (TLR)2,3,4. Нейтрофилы высвобождают предварительно сформированные цитокины и цитотоксическое содержимое гранул, которые затем могут вызвать повреждение коллатерального ткани. Последующее альвеолярное повреждение омрачается вторичной гибелью клеток, приводящей к высвобождению молекул, таких как аденозинтрифосфат (АТФ)5,тем самым устанавливая порочный круг иммунной дисрегуляции.
Нерешенная проблема в понимании АЛИ связана с вопросом о том, как инициируется травма внутри альвеолярной мембраны. Электронный транспортный комплекс V, F1F0 АТФ-синтаза, представляет собой митохондриальный белок, который, как известно, экспрессируется повсеместно на клеточной (включая эндотелиальную, лейкоцитарную, эпителиальную) плазматической мембране во время воспаления. Клеточный цитоскелет, который состоит из актина и тубулина, содержит много клеточной формы и модуляции функции, а также митохондриальных белков, соответственно. Недавно мы показали, что блокада АТФ-синтазы эндогенной молекулой, ангиостатином, заглушает рекрут нейтрофилов, активацию и липополисахарид (ЛПС) индуцирует воспаление легких6. Таким образом, как биохимические (АТФ-синтаза), так и иммунные (TLR4) механизмы могут регулировать альвеолярный барьер во время воспаления легких.
Воздействие озона (O3),загрязнителя окружающей среды, ухудшает функцию легких, повышает восприимчивость к легочным инфекциям, а короткие низкие уровни воздействия O3 увеличивают риск смертности у людей с основными кардиореспираторными состояниями7,8,9,10,11,12,13,14. Таким образом, воздействие физиологически значимых концентрацийО3 обеспечивает содержательную модель АЛИ для изучения фундаментальных механизмов воспаления7,8. Наша лаборатория недавно установила мышиную модель низкодозного Индуцированного O3 ALI15. После выполнения дозы и временного ответа на низкие концентрации O3 мы наблюдали, что воздействие 0,05 ppm O 3 в течение2 ч вызывает острое повреждение легких, которое характеризуется субъединицей β субъединица V атфсинтазы легких (ATPβ) и экспрессией ангиостатина, аналогично модели ЛПС. Прижизненная визуализация легких выявила дезорганизацию альвеолярных актиновых микрофиламентов, указывающих на повреждение легких, и абляцию альвеолярных септальных активных форм кислорода (АФК) (что указывает на отмену исходной клеточной сигнализации) и митохондриального мембранного потенциала (указывающего на острую гибель клеток) после 2 ч воздействия 0,05 ppm O315, что коррелировало с гетерогенным легочным 18удержанием FDG16,рекрутированием нейтрофилов и высвобождением цитокинов, в первую очередь IL-16 и SDF-1α. Вывод из наших недавних исследований заключается в том, что O3 вызывает экспоненциально высокую токсичность при воздействии в концентрациях ниже допустимых пределов 0,063 ppm в течение 8 ч (в день) для воздействия на человека. Важно отметить, что не существует четкого понимания того, могут ли эти субклинические воздействия O3 модулировать TLR4-опосредованные механизмы, такие как бактериальный эндотоксин17. Таким образом, мы изучили модель воздействия O3 и LPS с двойным ударом и наблюдали иммунную и неиммунные клеточные адаптации.
Мы описываем комплексный флуоресцентный микроскопический анализ различных легочных и системных компартментов тела, а именно бронхо-альвеолярной лаважной жидкости (т.е. BAL), которая пробует альвеолярные пространства, перфусат сосудов легких (т.е. LVP), который пробует легочную сосудистую сосудистую систему и альвеолярную перегородку интерстиций в случае компрометированного эндотелиального барьера, криосекций левого легкого, чтобы изучить резидентные паренхиматозные и адгезивные лейкоциты, оставшиеся в лавированной легочной ткани , периферическая кровь, которая представляет собой циркулирующие лейкоциты и перфузаты грудины и бедренного мозга, которые пробуют проксимальные и дистальные участки мобилизации кроветворных клеток во время воспаления, соответственно.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы, представленные в текущем исследовании, подчеркивают полезность анализа нескольких компартментов для изучения множественных клеточных событий во время воспаления легких. Мы обобщили выводы в таблице 2. Мы и многие лаборатории тщательно изучили реакцию мыша на интрана…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Проводимые исследования финансируются за счет гранта президента NSERC, а также стартовых фондов Канадского центра ядерных инноваций Сильвии Федорук. Канадский центр ядерных инноваций Сильвии Федорук финансируется innovation Saskatchewan. Флуоресцентная визуализация была выполнена в Центре визуализации WCVM, который финансируется NSERC. Джессика Брокос (MSc Student) и Манприт Каур (MSc Student) финансировались за счет стартовых фондов Канадского центра ядерных инноваций Сильвии Федорук.
Materials
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
Riferimenti
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
- Aulakh, G. K. Neutrophils in the lung: “the first responders”. Cell Tissue Research. , (2017).
- Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
- Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
- Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
- Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
- Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
- Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, 610-619 (2018).
- Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
- Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
- Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
- Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
- Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
- Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
- Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).
- Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).
- Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, 24 (2008).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Southam, D. S., Dolovich, M., O’Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
- Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
- Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
- Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
- Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
- Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochimica. 54 (33), 5185-5197 (2015).
- Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), 63-68 (1992).
- Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056 (2015).
- Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
- Gupta, A., et al. Extrapulmonary manifestations of COVID-19. Nature Medicine. 26 (7), 1017-1032 (2020).
- Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. . 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
- Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009 (2018).
