결합 된 오존 과 LPS 유도 뮤린 급성 폐 부상 동안 폐 세포 적응 시각화
Summary
결합 된 오존과 세균성 내독신 노출 마우스는 호중구의 것을 포함하여 광범위한 세포 죽음을 보여줍니다. 우리는 세포 골격 라멜레포디아의 중단, 기관지 폐포 라베이지의 복잡한 V ATP synthase 서브유닛 β 및 혈관 스타틴의 세포 발현 증가, 폐 면역 반응 억제 및 지연 된 호중구 모집과 같은 세포 적응을 관찰했습니다.
Abstract
폐는 멸균 (입자 또는 반응성 독소) 및 전염성 (세균성, 바이러스 또는 곰팡이) 염증 조건의 형태로 직접적이고 간접적인 모욕에 지속적으로 직면합니다. 압도적인 숙주 반응은 병리학적 숙주 면역, 응압 및 조직 리모델링 반응의 결과로 폐 호중구 모집을 특징으로 하는 손상된 호흡 및 급성 폐 손상을 초래할 수 있습니다. 소뇨폐 세포 적응을 시각화하고 정량화하는 민감한 현미경 방법은 저용량(0.05 ppm) 오존에 대응하여, TLR4 작용제인 세균성 리포폴리사카라이드와 함께 강력한 환경 오염물질로 숙주 염증 및 수리 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요합니다. 우리는 다양한 폐 및 전신 바디 구획, 즉 기관지-폐포라 라베지 액체, 폐 혈관 난투, 좌측 폐 극저섹션 및 흉골 골수 투과구의 포괄적인 형광 현미경 분석을 기술합니다. 당사는 분석된 구획에서 이산 케모킨 그라데이션에 의해 표시되는 지연(최대 36-72h) 면역 반응과 상관되는 골수 세포뿐만 아니라 폐포성 대식세포의 손상을 보여줍니다. 또한 폐 세포 외 매트릭스 및 세포 세포 종편 상호 작용 (액틴, 튜룰린), 미토콘드리아 및 반응성 산소 종, 항 응고 성 플라스미노겐, 항 혈관 신생 펩타이드 단편 혈관 산기 세포 혈관, 미토콘드리아 ATP 시네시아 복합 V 서브 유닛, α 및 β 제시합니다. 이러한 대리 마커는 적절한 체외 세포 기반 분석술및 생체 내 미생물 현미경 검사법과 같은 생체 내 동물 이미징 기술로 보충될 때, 새로운 면역 조절제에 대한 폐 반응을 이해하는 쪽으로 중요한 정보를 제공할 수 있다.
Introduction
급성 폐 손상(ALI)은 응고, 섬유성 및 선천성 면역 계통1의동시 활성화에 의해 표시되는 전염성 또는 기타 유해한 자극에 대한 폐의 중요한 병리학 반응이다. 호중구는 즉시 톨과 같은 수용체 (TLR) 패밀리2,3,4를통해 미생물 및 세포 내 손상 패턴을 감지합니다. Neutrophils는 그 때 부수적인 조직 손상을 일으키는 원인이 될 수 있는 미리 형성된 사이토카인 및 세포독성 과립 내용을 풀어 놓습니다. 이어지는 폐포 손상은 아데노신 삼위산염 (ATP)5와같은 분자의 방출로 이어지는 이차 세포 죽음으로 손상되어 면역 dysregulation의 악순환에서 설정됩니다.
ALI의 이해에 해결되지 않은 문제는 발포막 내에서 부상이 어떻게 시작되는지에 대한 문제와 관련이 있습니다. 전자 수송 복합체 V, F1F0 ATP 신타제는 염증 중 세포(내피, 백혈구, 상피 포함)에서 유비쿼터스로 발현되는 것으로 알려진 미토콘드리아 단백질이다. 액틴과 튜룰린으로 구성된 세포 골격은 미토콘드리아 단백질뿐만 아니라 많은 세포 모양과 기능 변조를 각각 항구합니다. 우리는 최근에 내인성 분자, 혈관 스타틴, 침묵 호중구 모집, 활성화 및 리포 폴리사카라이드 (LPS)에 의해 ATP synthase의 봉쇄가 폐 염증6을유도하는 것으로 나타났습니다. 따라서, 생화학적(ATP synthase)과 면역(TLR4) 메커니즘은 폐 염증 시 폐포 장벽을 조절할 수 있다.
오존(O3)에 노출되면 환경 오염물질, 폐 기능 저하, 폐 감염에 대한 감수성을 증가시키고,O3 노출의 짧은 저수준은 근기 심폐질환7,8,9,10,11,12, 13,14의기초심률을 가진 이들의 사망률 위험을 증가시킨다. 따라서,O3의 생리학적관련 농도에 노출되면 염증7,8의근본적인 기전을 연구하기 위한 ALI의 의미 있는 모델을 제공한다. 우리 실험실은 최근 저용량 O3 유도 ALI 15의 뮤린 모델을설립했다. 낮은O3 농도에 대한 투여량 및 시간 반응을 수행한 후, LPS 모델과 유사한 폐 ATP 신타제 복합 V 서브유닛 β(ATPβ) 및 혈관스타틴 발현에 의해 표시되는 급성 폐 손상을 유도하는 것을 관찰하였다. 인트라바이탈 폐 이미징은 폐 손상을 나타내는 폐포액소균의 해체를 밝혀, 및 폐포 중격 반응성 산소 종(ROS) 수준(기준세포 신호의 변색을 나타내는) 및 미토콘드리아 막 전위(급성 세포 사멸을 나타내는)의 절제는 이질성 폐 18FDG 보존16,중성구 모집 및 사이토메16-16, 중성구 모집 및 사이토메킨 방출과 상관관계가 있는 0.05 ppm O315에 2시간 노출 후 우리의 최근 연구에서 테이크 홈 메시지는 O3 인간의 노출에 대 한 8 시간 (하루) 허용 된 한계 아래 농도에 노출 될 때 기하 급수적으로 높은 독성을 생산. 중요하게도, 이러한 하위 임상O3 노출이 세균성 내독소(17)에 의한 TLR4 매개메커니즘을 조절할 수 있는지에 대해서는 명확한 이해가 존재하지 않는다. 따라서, 우리는 이중 히트 O3 및 LPS 노출 모델을 공부하고 면역 및 비 면역 세포 적응을 관찰했다.
우리는 다양한 폐 및 전신 바디 구획, 즉 기관지 폐포 라베지 액체의 포괄적인 형광 현미경 분석을 기술합니다 (즉,, BAL) 폐포 공간을 샘플링하는, 폐 혈관 난간 (즉, LVP)은 폐 혈관 과 폐 막증을 시료하고 폐경 벽이 손상된 경우 폐 극저섹션을 남기고, 상주 피렌자피 및 부착 된 leuks좌를 들여다 보는 , 순환백혈구체와 흉골 및 대퇴골골수를 나타내는 말초 혈액은 각각 염증 중 조혈 세포 동원의 근해 및 말단 부위를 시료하는 양상동맥 및 대퇴골 골수와 이복된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 연구에서 제시된 방법은 폐 염증 도중 다중 세포 사건을 공부하기 위하여 다중 구획 분석의 유용성을 강조합니다. 표 2의결과를 요약했습니다. 우리와 많은 실험실은 광범위하게 폐 호중구의 급속한 모집에 의해 표시되는 비강 LPS 주입에 뮤린 반응을 연구했습니다, 이는 6-24 시간 사이 피크, 해상도차기. 그리고 최근에는 서브임상O3(2시간 동안 0.05ppm)만으로도 폐 혈관 구?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 대통령의 NSERC 보조금과 실비아 페도루크 캐나다 원자력 혁신 센터의 스타트업 기금에 의해 지원됩니다. 실비아 페도루크 캐나다 원자력 혁신 센터는 혁신 서스캐처원의 지원을 받고 있습니다. 형광 화상 진찰은 NSERC에 의해 투자되는 WCVM 화상 진찰 센터에서 수행되었습니다. 제시카 브로코스(MSc 학생)와 만프리트 카우르(MSc Student)는 실비아 페도루크 캐나다 원자력 혁신 센터의 스타트업 기금으로 지원받았다.
Materials
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
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