Summary
We bieden een protocol voor neonatale cardiale macrofaagscheiding en transplantatie in een volwassen muizenhart, wat een veelbelovende manier kan zijn om hartherstel te bevorderen.
Abstract
In een gewond neonatale myocardium vergemakkelijken macrofagen de proliferatie van cardiomyocyten en angiogenese en bevorderen ze de regeneratie van het hart. De huidige studie toont aan dat transplantatie van neonatale cardiale macrofagen gerekruteerd door letsel de regeneratie van het volwassen hart bevordert na een hartinfarct met verbetering van de hartfunctie en cardiomyocytenproliferatie. De resultaten geven aan dat neonatale cardiale macrofaagtransplantatie een veelbelovende strategie kan zijn voor de behandeling van hartletsel. Hier geven we de technische details, waaronder de isolatie van neonatale cardiale macrofagen van apicale resectie-gewonde neonatale muizenharten, de transplantatie van macrofagen in myocardinfarcten van volwassen muizen en de schatting van hartregeneratie na een macrofaagtransplantaat.
Introduction
Hartregeneratie is een veelbelovende strategie om de hartfunctie te herstellen na hartletsel en te beschermen tegen hartfalen1,2,3. Na myocardiale verwonding infiltreren macrofagen het gewonde hart en zijn onderzocht als de belangrijkste factoren tijdens neonatale hartregeneratie4,5,6. Naast het opruimen van necrotisch cellulair puin en het induceren van ontstekingen, bevorderen macrofagensieangiogenese 5 en cardiomyocytenproliferatie7 na een myocardinfarct van neonatale muizen.
Onze eerdere studie illustreert dat transplantatie van neonatale cardiale macrofagen geïsoleerd uit gewond neonatale harten de regeneratie van het volwassen hart verbetert7, wat aangeeft dat neonatale cardiale macrofaagtransplantatie een veelbelovende strategie zou kunnen zijn om hartletsel te behandelen. Hier geven we de technische details, waaronder isolatie van neonatale cardiale macrofagen van apicale resectie-gewonde neonatale muizenharten, de transplantatie van macrofagen in myocardinfarcten van volwassen muizen en de schatting van hartregeneratie na macrofaagtransplantaat (figuur 1).
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor het Gebruik en de Verzorging van Proefdieren. Alle dierprotocollen werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences. Aseptische techniek is vereist tijdens de hele procedure om besmetting van de operatieplaats te voorkomen.
1. Apicale resectie operatie in neonatale 1-dag-oude Cx3cr1 GFP / + muis(C57BL / 6 achtergrond)
- Anesthesie
- Haal alle muizenpups uit de kooien en leg ze in een schone droge doos.
- Sluit elke muis ongeveer 2-3 minuten in het ijs. Zorg ervoor dat er een dunne barrière zoals latex of gaas tussen het ijs en de muizenpup zit om bevriezing te voorkomen.
- Identificeer voldoende anesthesie door te letten op de volgende symptomen: bleke huid, gebrek aan beweging van de ledematen en gebrek aan pedaalreflex.
- Thoracotomie
- Koel het bronzen bedieningsplatform 's nachts bij -20 °C om de anesthesie te helpen behouden.
- Haal de verdoofde muis uit de ijskist en zet hem op een bronzen bedieningsplatform. Veranker de muis op het bedieningsplatform in rugligging met behulp van medisch plakband.
- Plaats het bedieningsplatform met de muis erop onder een stereoscoop.
- Desinfecteer de muizenkist met behulp van een prep pad gedrenkt met betadine en 70% alcohol of in overeenstemming met het institutionele beleid.
- Snijd de huid in met een snede van 1 cm in het vierde intercostale gebied van de borstholte en scheid vervolgens de intercostale spieren met behulp van een microchirurgische schaar totdat het hart toegankelijk is.
- Druk afwisselend op de borst en de buik met behulp van twee tangen totdat het hart uit de borst is gepuitwend zonder enige mechanische schade.
- Plaats de ribben onder en boven de kleine incisie als een natuurlijke fixatie om het hart te immobiliseren.
- Ventriculaire apex resectie
- Zoek de top van de linker ventrikel. Knip een 1 mm diameter van ventriculaire apexweefsel met behulp van een iridectomieschaar onder een stereoscoop.
- Bevestig dat de linkerventrikelkamer is blootgesteld en begin te sijpelen.
- Druk het hart voorzichtig terug naar de borstholte met een wattenstaafje.
- Hecht de spieren, ribben en huid met 8-0 Prolene hechtingen.
- Reinig de muis grondig na de operatie.
- Zorg na de operatie
- Breng de muis van het bedieningsplatform over naar een verwarmingsdeken van 37 °C om het lichaam onmiddellijk na de operatie op te warmen.
- Bevestig deabiose van de muis door te letten op de volgende tekenen: spontaan ademhalingsherstel, huidskleurverandering van bleek naar roze en beweging van ledematen.
- Breng de geopereerde muis terug naar zijn moeder zodra deze is hersteld.
- Meng de geopereerde muis indien nodig met de nestmaterialen van zijn moeder.
OPMERKING: Het is belangrijk om alle 1-dag-oude pups in één keer van de moeder te verwijderen en ze vervolgens allemaal in één keer terug te brengen nadat alle pups zijn hersteld.
2. Bereiding van de neonatale cardiale macrofaagsuspensie
OPMERKING: Al deze experimentele procedures moeten worden uitgevoerd op een donkere plaats en onder steriele omstandigheden.
- Oogst het hart van een neonatale Cx3cr1GFP/+ muis 1 dag na apicale resectie
- Euthanaseer de Cx3cr1GFP/+ muis een dag na de apicale resectie. Gebruik een teveel aan koolstofdioxide en onthoofd de muis achtereenvolgens om euthanasie toe te passen.
- Haal het hart uit de borst en dompel het onder in een schaal van 10 cm met PBS.
- Snijd de vaten en het resterende bindweefsel weg van de ventrikels. Snijd de auriculaire appendix en het uitstroomkanaal weg van het hart.
- Nadat het hart stopt met kloppen, snijdt u het hart in 1-2 mm3 stukken in PBS-buffer met behulp van een microchirurgische schaar(figuur 2A).
- Neonatale muis hartdissociatie
- Breng het geoogste hartweefsel over in een buis met 2,5 ml voorverwarmd enzymmengsel(Tabel met materialen)en sluit de buis goed af.
- Keer de buis om en plaats deze met de dop naar beneden(figuur 2B).
- Voer het neonatale hartdissociatieprogrammauit (Tabel met materialen).
- Maak de buis los van de dissociator nadat het programma is voltooid.
- Voeg 7,5 ml 1x DMEM met 10% FBS toe aan de buis.
- Filtreer en breng de suspensie over in een centrifugebuis van 15 ml(figuur 2C). Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 minuten.
- Resuspend de celkorrel in 1 ml bloedcellysisoplossing en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 5-10 ml PBS-buffer toe aan de suspensie en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g.
- Resuspend de celkorrel in 1 ml DMEM met 10% FBS.
- Neonatale cardiale macrofaagisolatie
- Sorteer GFP+ neonatale cardiale macrofagen op FACS. Ontvang de gesorteerde macrofagen in een steriele buis met 500 μL DMEM met 10% FBS.
- Tel de GFP+ macrofagen(Figuur 2D). Resuspend de macrofaag in DMEM met 10% FBS in de concentratie van 1 x 106 macrofagen per 200 μL DMEM voor latere injectie.
OPMERKING: Het aantal GFP+ macrofagen is klein in één pasgeborene (ongeveer 1 x 105); daarom moeten ten minste 10 pasgeborenen worden gebruikt om voldoende macrofagen te verkrijgen voor elke injectie van volwassen muizen.
3. Neonatale cardiale macrofaagtransplantatie
- Voer een myocardinfarctoperatie uit bij een volwassen (6-8 weken oude) mannelijke C57BL / 6-muis door ligatie van de linker voorste kransslagader8.
- Leg de geopereerde muis op een verwarmde deken van 37 °C totdat deze zich herstelt.
- Injecteer intraveneus 200 μL DMEM met 1 x 106 GFP+ neonatale cardiale macrofagen in de infarctige volwassen muis na de operatie (ongeveer 6 uur later) via de staartader.
- Stuur de muis terug naar een schone kooi.
4. Resultaatevaluatie
- Validatie van de injectie-efficiëntie
- Verdoof de geopereerde muis en oogst het hart 7 dagen na het hartinfarct.
- Dompel het hart onder in de voorgekoelde PBS-buffer.
- Fixeer het hartweefsel met 4% polyformaldehyde gedurende 72 uur bij kamertemperatuur met schudden.
- Droger het hartweefsel in dimethylbenzeen en ethanol.
- Sluit het hartweefsel in paraffine in en snijd het in secties met een dikte van 5 μm.
- Voer het standaard immunofluorescentiekleuringsprotocoluit 1. Gebruik α-actinine om cardiomyocyten te markeren.
- Detecteer de GFP+ macrofagen in het hart dat transplantatie ontvangt.
- Voer het standaard immunofluorescentiekleuringsprotocoluit 1. Gebruik α-actinine en pH3 om respectievelijk cardiomyocyten en celproliferatie te markeren(figuur 3A).
- Hartherstel evaluatie na de transplantatie
- Gebruik echocardiografie op de geopereerde muis een maand na de operatie1.
- Analyseer de hartfunctie door de linkerventrikel ejectiefractie en fractionele verkorting in verschillende groepen te vergelijken(figuur 3B).
- Verdoof de geopereerde muis en oogst het hart.
- Herhaal stap 4.1.2-4.1.5.
- Voer een Masson's kleuringsprotocol uit.
- Analyseer het infarctgebied na macrofaaginjectie(figuur 3C).
Representative Results
Het hier beschreven protocol is samengevat in een stroomschema (Figuur 1). We voerden apicale resectiebewerking uit op de 1 dag oude Cx3cr1GFP/+ muis. Zoals te zien is in figuur 2A,werd de neonatale Cx3cr1GFP/+ muis na anesthesie verankerd op het operatieplatform onder de stereoscoop. We oefenden afwisselend druk uit op de borst en buik van de muis met behulp van twee tangen, die kunnen worden opgezet als een kanaal om het hart uit de borst te laten springen. Extra mechanische schade aan het hart die de regeneratie van het hart kan beïnvloeden, moet worden vermeden. Het hart werd geïmmobiliseerd door de omliggende borstweefsels, wat de operatie aan het myocard vergemakkelijkte. We ontdekten dat het afsnijden van minder dan een diameter van 1 mm van het gereseceerde apexweefsel door een iridectomieschaar geschikt was toen de linkerventrikelkamer begon te sijpelen. Succesvolle inductie van apicale resectiemodel is noodzakelijk voor macrofaagtransplantatie8,9.
We sorteerden de GFP+ macrofagen strikt volgens een neonatale hartdissociatieprotocol1 (figuur 2).
Neonatale cardiale macrofagen werden kort na de isolatie geïnjecteerd in het myocardinfarct van de volwassen muis. Om de efficiëntie van de macrofaagtransplantatie te bevestigen, voerden we immunofluorescentiekleuring uit 7 dagen na de injectie. De resultaten toonden aan dat GFP+ macrofagen konden worden gevonden in het volwassen myocardiale infarct muizenhart, wat wijst op de succesvolle transplantatie van neonatale cardiale macrofaag. We gebruikten co-immunostaining van pH3 met α-actinine. De colokalisatie werd beschouwd als cardiomyocytenproliferatie. De resultaten illustreerden dat het aantal proliferatieve cardiomyocyten was opgesijpt in de macrofaag-geïnjecteerde groep, wat aangeeft dat het proliferatievermogen van volwassen cardiomyocyten na de transplantatie was verbeterd(figuur 3).
De regeneratie van het hart van volwassen muizen werd 1 maand na de transplantatie geëvalueerd. We voerden echocardiogram uit op de volwassen muis en ontdekten dat macrofaaginjectie de hartfunctie na een hartinfarct kon verbeteren. Masson's kleuring werd uitgevoerd en de resultaten illustreerden dat het infarctgebied opmerkelijk verminderd was na de neonatale cardiale macrofaagtransplantatie(figuur 3). Al deze resultaten toonden aan dat neonatale cardiale macrofaagtransplantatie de regeneratie van het hart van volwassen muizen en de proliferatie van cardiomyocyten bevordert.
Figuur 1: Schematische weergave van neonatale cardiale macrofaagtransplantatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Afbeeldingen van macrofaagisolatie. A) De harten worden in kleine stukjes gesneden. B) De muizenharten zijn gedissocieerd. C)De suspensie wordt gefilterd en overgebracht naar een centrifugebuis van 15 ml. D) Het aantal neonatale cardiale macrofagen wordt berekend. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Neonatale cardiale macrofaagtransplantatie bevordert de regeneratie van het volwassen hart. A) (Links) Immunofluorescentiebeelden tonen de proliferatieve cardiomyocyten (pijl, pH3 groen, α-actinine rood). (Rechts) Statistische analyse toont aan dat de proliferatie van cardiomyocyten toeneemt na macrofaagtransplantatie. B) (Links) Echocardiogrambeelden tonen de hartfunctie bij volwassen muizen 1 maand na een hartinfarct. (Rechts) Statistische analyse toont aan dat de hartfunctie verbetert na macrofaagtransplantatie. C) Masson's kleuring toont het infarctgebied bij volwassen muizen 1 maand na myocardinfarct. (Rechts) Statistische analyse toont aan dat het infarctgebied kleiner wordt na Mφ, macrofaagtransplantatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Hier bieden we een effectieve aanpak voor het voorbereiden, verwerven en transplanteren van neonatale cardiale macrofagen om de regeneratie van het hart van volwassen muizen te bevorderen.
Apicale resectie is een eenvoudige en effectieve operatie om de regeneratie van het hart te stimuleren. We hebben de details van apicale resectie geoptimaliseerd om de maximale overlevingskans van de dieren die betrokken zijn bij de operatie te garanderen10. De anesthesietijd mag niet langer zijn dan 3 minuten, wat leidt tot door onderkoeling veroorzaakte dood, of korter dan 2 minuten, wat tijdens de operatie overmatig bloeden zou veroorzaken. De standaard apicale resectie moest ongeveer 1,5 mm diameter van het apexweefsel amputeren. Het doel van de operatie hier was echter om overvloedige macrofaaginfiltratie tijdens het hartregeneratieproces te stimuleren. Resectie met een diameter van minder dan 1,5 mm was aanvaardbaar omdat deze tegelijkertijd een maximale overlevingskans en effectieve macrofaagrekrutering kon garanderen. Alleen de vaardigheid van de operator beïnvloedde de overlevingskans en de geopereerde muizen konden de verlengde werkingsduur niet overleven. De operator moet de hele procedure binnen 5 minuten voltooien.
In onze vorige studie ontdekten we dat acute ontsteking neonatale hartregeneratie bevorderde. Intramyocardiale micro-injectie van immunogene zymosan A-deeltjes in neonatale muizenhart kan de proliferatie van cardiomyocyten bevorderen6. Onlangs beweerden Molkentin et al. dat macrofaaginfiltratie die wordt gestimuleerd door intracardiale injectie van zymosan A, celresten en bevroren / dooi gedode cellen hartherstel kan bevorderen, wat bevestigt dat acute ontsteking en macrofagen essentieel zijn bij hartherstel in plaats van stamcellen die differentiëren in cardiomyocyten11. Sadek et al.5 meldden dat macrofagen neonatale hartregeneratie konden bevorderen via angiogenese. Onze recente studie toonde aan dat neonatale cardiale macrofaaginjectie de regeneratie van het volwassen hart kan bevorderen en het vermogen van proliferatie van volwassen cardiomyocyten kan verhogen1,7. Neonatale cardiale macrofaagtransplantatie kan een veelbelovende strategie zijn om de regeneratie van het hart van volwassen muizen te bevorderen. Hier presenteren we de protocollen om meer onderzoekers te helpen bij de ontwikkeling van regeneratieve toepassingen en het verkennen van hartregeneratiemechanismen.
Disclosures
Geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Chinese Academy of Medical Sciences Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS, 2016-I2M-1-015), het National Key Research and Development Project of China (2019YFA0801500), de National Natural Science Foundation of China (NSFC: 81970243, 81770308), Beijing Natural Science Foundation (7172183, 7182140).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse alpha actinin | Abcam | Ab9465 | |
| Anti-phospho-Histone H3 | Millipore | 06-570 | |
| Anti-rabbit Aurora B | Abcam | Ab239837 | |
| Anti-rabbit Ki67 | Abcam | Ab15580 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany | N/A | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21137 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit | Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany | 130-098-373 |
References
- Li, Y., et al. gp130 Controls Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration. Circulation. 142 (10), 967-982 (2020).
- Pei, J., et al. Hydrogen Sulfide Promotes Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration via ROS Scavenging. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 1412696 (2020).
- Wang, Y., et al. Mydgf promotes Cardiomyocyte proliferation and Neonatal Heart regeneration. Theranostics. 10 (20), 9100-9112 (2020).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Han, C., et al. Acute inflammation stimulates a regenerative response in the neonatal mouse heart. Cell Research. 25 (10), 1137-1151 (2015).
- Li, Y., et al. Transplantation of murine neonatal cardiac macrophage improves adult cardiac repair. Cellular & Molecular Immunology. , (2020).
- Yue, Z., et al. PDGFR-β Signaling Regulates Cardiomyocyte Proliferation and Myocardial Regeneration. Cell Reports. 28 (4), 966-978 (2019).
- Wang, J., et al. A long noncoding RNA NR_045363 controls cardiomyocyte proliferation and cardiac repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 127, 105-114 (2019).
- Li, Y., et al. Achieving stable myocardial regeneration after apical resection in neonatal mice. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (11), 6500-6504 (2020).
- Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577 (7790), 405-409 (2020).
