Summary
Wir bieten ein Protokoll für die Trennung und Transplantation von neonatalen kardialen Makrophagen in ein erwachsenes Mausherz, das ein vielversprechender Weg zur Förderung der Herzreparatur sein könnte.
Abstract
Bei einem verletzten neonatalen Myokard erleichtern Makrophagen die Kardiomyozytenproliferation und Angiogenese und fördern die Herzregeneration. Die vorliegende Studie zeigt, dass die Transplantation von neonatalen Herzmakrophagen, die durch Verletzungen rekrutiert werden, die Herzregeneration von Erwachsenen nach Myokardinfarkt mit Verbesserung der Herzfunktion und der Kardiomyozytenproliferation fördert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die neonatale kardiale Makrophagentransplantation eine vielversprechende Strategie für die Behandlung von Herzverletzungen sein könnte. Hier liefern wir die technischen Details, einschließlich der Isolierung von neonatalen Herzmakrophagen aus apikalen Resektion-verletzten neonatalen Mausherzen, der Transplantation von Makrophagen in myokardinfarktierte erwachsene Mäuse und der Abschätzung der Herzregeneration nach einem Makrophagentransplantat.
Introduction
Die Herzregeneration ist eine vielversprechende Strategie, um die Herzfunktion nach einer Herzverletzung wiederherzustellen und vor Herzinsuffizienz zu schützen1,2,3. Nach einer Myokardverletzung infiltrieren Makrophagen das verletzte Herz und wurden als Schlüsselfaktoren während der neonatalen Herzregeneration erforscht4,5,6. Neben der Beseitigung nekrotischer Zelltrümmer und der Induktion von Entzündungen fördern Makrophagen die Angiogenese5 und die Kardiomyozytenproliferation7 nach neonatalen Mäuse-Myokardinfarkt.
Unsere vorherige Studie zeigt, dass die Transplantation von neonatalen Herzmakrophagen, die aus verletztem neonatalem Herz isoliert wurden, die Herzregeneration bei Erwachsenen verbessert7, was darauf hindeutet, dass die neonatale herzmakrale Makrophagentransplantation eine vielversprechende Strategie zur Behandlung von Herzverletzungen sein könnte. Hier liefern wir die technischen Details, einschließlich der Isolierung von neonatalen herzmakrophagen aus apikalen Resektion-verletzten neonatalen Mausherzen, der Transplantation von Makrophagen in myokardinfarktierte erwachsene Mäuse und der Abschätzung der Herzregeneration nach Makrophagentransplantat (Abbildung 1).
Protocol
Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Verwendung und Pflege von Versuchstieren durchgeführt. Alle Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences genehmigt. Während des gesamten Eingriffs ist eine aseptische Technik erforderlich, um eine Kontamination der Operationsstelle zu verhindern.
1. Apikale Resektionsoperation in neonataler 1 Tag alter Cx3cr1 GFP/+ Maus(C57BL/6 Hintergrund)
- Anästhesie
- Nehmen Sie alle Mauswelpen aus den Käfigen und legen Sie sie in eine saubere, trockene Box.
- Betten Sie jede Maus für ca. 2-3 Minuten in das Eis ein. Stellen Sie sicher, dass sich zwischen dem Eis und dem Mauswelchen eine dünne Barriere wie Latex oder Gaze befindet, um Erfrierungen zu vermeiden.
- Identifizieren Sie eine ausreichende Anästhesie, indem Sie auf die folgenden Anzeichen achten: blasse Haut, mangelnde Gliedmaßenbewegung und mangels Pedalreflex.
- Thorakotomie
- Vorkühlen Sie die Bronze-Operationsplattform über Nacht bei -20 °C, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.
- Nehmen Sie die betäubte Maus aus dem Eiskasten und legen Sie sie auf eine bronzene Bedienplattform. Verankern Sie die Maus mit medizinischem Klebeband in Rückenlage auf der Bedienplattform.
- Legen Sie die Bedienplattform mit der Maus darauf unter ein Stereoskop.
- Desinfizieren Sie die Brust der Maus mit einem mit Betadin und 70% Alkohol getränkten Vorbereitungspad oder im Einklang mit der institutionellen Politik.
- Schneiden Sie die Haut mit einem 1 cm Schnitt am vierten Interkostalbereich der Brusthöhle und trennen Sie dann die Interkostalmuskulatur mit einer mikrochirurgischen Schere, bis das Herz zugänglich ist.
- Drücken Sie abwechselnd Brust und Bauch mit Hilfe von zwei Zetten, bis das Herz ohne mechanische Schäden aus der Brust heraus außen heraus ist.
- Setzen Sie die Rippen unter und über dem kleinen Schnitt als natürliche Fixierung, um das Herz zu immobilisieren.
- Ventrikuläre Apexresektion
- Lokalisieren Sie die Spitze des linken Ventrikels. Schneiden Sie einen Durchmesser von 1 mm ventrikulärem Spitzengewebe mit einer Iridektomieschere unter einem Stereoskop.
- Bestätigen Sie, dass die linke Kammer freigelegt ist, und beginnen Sie zu sickern.
- Drücken Sie das Herz vorsichtig mit einem Wattestäbchen zurück in die Brusthöhle.
- Nähen Sie die Muskeln, Rippen und Haut mit 8-0 Prolene-Nähte.
- Reinigen Sie die Maus nach der Operation gründlich.
- Nachsorge
- Übertragen Sie die Maus von der Bedienplattform auf eine 37 °C Heizdecke, um den Körper unmittelbar nach der Operation aufzuwärmen.
- Bestätigen Sie die Anabiose der Maus, indem Sie auf die folgenden Anzeichen achten: spontane Wiederherstellung der Atmung, Hautfarbe von blass zu rosa und Bewegung der Gliedmaßen.
- Bringen Sie die operierte Maus zurück zu ihrer Mutter, sobald sie sich erholt hat.
- Mischen Sie die operierte Maus bei Bedarf mit den Nistmaterialien ihrer Mutter.
HINWEIS: Es ist wichtig, alle 1 Tag alten Welpen auf einmal von der Mutter zu entfernen und sie dann alle auf einmal zurückzugeben, nachdem alle Welpen geborgen wurden.
2. Herstellung der neonatalen kardialen Makrophagensuspension
HINWEIS: Alle diese experimentellen Verfahren sollten an einem dunklen Ort und unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.
- Ernten Sie das Herz einer neonatalen Cx3cr1GFP/+ Maus 1 Tag nach apikaler Resektion
- Euthanasiern Sie die Cx3cr1GFP/+ Maus einen Tag nach der apikalen Resektion. Verwenden Sie einen Überschuss an Kohlendioxid und enthaupten Sie die Maus nacheinander, um Euthanasie anzuwenden.
- Nehmen Sie das Herz aus der Brust und tauchen Sie es in eine 10 cm große Schüssel mit PBS.
- Schneiden Sie die Gefäße und das verbleibende Bindegewebe von den Ventrikeln weg. Schneiden Sie den aurikulären Blinddarm und den Ausflusstrakt vom Herzen weg.
- Nachdem das Herz aufhört zu schlagen, schneiden Sie das Herz in PBS-Puffer mit einer mikrochirurgischen Schere in1-2 mm 3 Stück (Abbildung 2A).
- Neugeborene Mausherzdissoziation
- Übertragen Sie das entnommene Herzgewebe in ein Röhrchen mit 2,5 ml vorgewärmter Enzymmischung(Materialtabelle)und schließen Sie das Röhrchen fest.
- Kehren Sie das Rohr um, und legen Sie es mit der Kappe nach unten (Abbildung 2B).
- Führen Sie das Neonatal Heart Dissoziationsprogramm aus (Materialtabelle).
- Lösen Sie das Rohr vom Dissoziator, nachdem das Programm abgeschlossen ist.
- Fügen Sie 7,5 ml 1x DMEM mit 10% FBS in die Röhre hinzu.
- Filtern und übertragen Sie die Suspension in ein 15 mL Zentrifugenrohr (Abbildung 2C). Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 5 Minuten.
- Das Zellpellet in 1 ml Blutzelllyselösung wieder aufwirbeln und 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
- Fügen Sie 5-10 ml PBS-Puffer zur Suspension und Zentrifuge bei 300 x g für 5 Minuten hinzu.
- Das Zellpellet wird in 1 ml DMEM mit 10% FBS resuspendiert.
- Neonatale kardiale Makrophagenisolierung
- Sortieren Sie GFP+ neonatale Herzmakrophagen nach FACS. Erhalten Sie die sortierten Makrophagen in einem sterilen Röhrchen mit 500 μL DMEM mit 10% FBS.
- Zählen Sie die GFP+ Makrophagen (Abbildung 2D). Resuspend den Makrophagen in DMEM mit 10% FBS in der Konzentration von 1 x 106 Makrophagen pro 200 μL DMEM für die spätere Injektion.
HINWEIS: Die Anzahl der GFP+ Makrophagen ist bei einem Neugeborenen klein (ungefähr 1 x 105); Daher sollten mindestens 10 Neugeborene verwendet werden, um genügend Makrophagen für jede erwachsene Mausinjektion zu erhalten.
3. Neonatale kardiale Makrophagentransplantation
- Führen Sie eine Myokardinfarktoperation an einer erwachsenen (6-8 Wochen alten) männlichen C57BL/6-Maus durch Ligatur der linken vorderen Koronararteriedurch 8.
- Legen Sie die operierte Maus auf eine 37 °C heizte Decke, bis sie sich erholt.
- Intravenös 200 μL DMEM mit 1 x 106 GFP+ neonatalen Herzmakrophagen nach der Operation (ca. 6 Stunden später) über die Schwanzvene in die infarkte erwachsene Maus injizieren.
- Senden Sie die Maus zurück in einen sauberen Käfig.
4. Ergebnisbewertung
- Validierung der Einspritzeffizienz
- Betäuben Sie die operierte Maus und ernten Sie das Herz 7 Tage nach der Myokardinfarktoperation.
- Tauchen Sie das Herz in den vorgekühlten PBS-Puffer.
- Fixieren Sie das Herzgewebe mit 4% Polyformaldehyd für 72 Stunden bei Raumtemperatur mit Schütteln.
- Dehydrieren Sie das Herzgewebe in Dimethylbenzol und Ethanol.
- Das Herzgewebe in Paraffin einbetten und in Abschnitte mit einer Dicke von 5 μm schneiden.
- Führen Sie das Standard-Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll1durch. Verwenden Sie α-Actinin, um Kardiomyozyten zu markieren.
- Erkennen Sie die GFP+ Makrophagen im Herzen, das eine Transplantation erhält.
- Führen Sie das Standard-Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll1durch. Verwenden Sie α-Actinin und pH3, um Kardiomyozyten bzw. Zellproliferation zu markieren (Abbildung 3A).
- Herzreparaturbewertung nach der Transplantation
- Verwenden Sie die Echokardiographie an der operierten Maus einen Monat nach der Operation1.
- Analysieren Sie die Herzfunktion durch Vergleich der linksventrikulären Ejektionsfraktion und der fraktionellen Verkürzung in verschiedenen Gruppen (Abbildung 3B).
- Betäuben Sie die operierte Maus und ernten Sie das Herz.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.1.2-4.1.5.
- Führen Sie ein Masson-Färbeprotokoll durch.
- Analysieren Sie den infarktierten Bereich nach der Makrophageninjektion (Abbildung 3C).
Representative Results
Das hier beschriebene Protokoll ist in einem Flussdiagramm zusammengefasst (Abbildung 1). Wir führten eine apikale Resektionsoperation an der 1 Tag alten Cx3cr1GFP/+ Maus durch. Wie in Abbildung 2Adargestellt, wurde die neonatale Cx3cr1GFP/+ Maus nach der Betäubung auf der Operationsplattform unter dem Stereoskop verankert. Wir übten abwechselnd Druck auf Brust und Bauch der Maus mit Hilfe von zwei Zrangetten aus, die als Trakt eingerichtet werden können, um das aus der Brust springende Herz zu führen. Jede zusätzliche mechanische Schädigung des Herzens, die die Herzregeneration beeinträchtigen kann, sollte vermieden werden. Das Herz wurde durch das umgebende Brustgewebe immobilisiert, was die Operation am Myokard erleichterte. Wir fanden heraus, dass das Abschneiden von weniger als 1 mm Durchmesser des resezierten Spitzengewebes mit einer Iridektomieschere angemessen war, wenn die linke Kammer zu nässen begann. Eine erfolgreiche Induktion des apikalen Resektionsmodells ist für die Makrophagentransplantation notwendig8,9.
Wir sortierten die GFP+ Makrophagen streng nacheinem neonatalen Herzdissoziationsprotokoll 1 (Abbildung 2).
Neonatale Herzmakrophagen wurden kurz nach der Isolierung in das myokardinfarktierte erwachsene Mausherz injiziert. Um die Wirksamkeit der Makrophagentransplantation zu bestätigen, führten wir 7 Tage nach der Injektion eine Immunfluoreszenzfärbung durch. Die Ergebnisse zeigten, dass GFP+ Makrophagen im erwachsenen myokardinfarktierten Mausherz gefunden werden konnten, was auf die erfolgreiche Transplantation des neonatalen Herzmakrophagen hinweist. Wir verwendeten die Co-Immunfärbung von pH3 mit α-Actinin. Die Co-Lokalisation wurde als Kardiomyozytenproliferation angesehen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Anzahl der proliferativen Kardiomyozyten in der Makrophagen-injizierten Gruppe hochreguliert war, was darauf hindeutet, dass die Proliferationsfähigkeit der adulten Kardiomyozyten nach der Transplantation verbessert war (Abbildung 3).
Die Herzregeneration bei erwachsenen Mäusen wurde 1 Monat nach der Transplantation untersucht. Wir führten ein Echokardiogramm an der erwachsenen Maus durch und fanden heraus, dass die Makrophageninjektion die Herzfunktion nach einem Myokardinfarkt verbessern könnte. Massons Färbung wurde durchgeführt, und die Ergebnisse zeigten, dass der Infarktbereich nach der neonatalen herzmakrophagentransplantation bemerkenswert reduziert wurde (Abbildung 3). All diese Ergebnisse zeigten, dass die neonatale kardiale Makrophagentransplantation die Herzregeneration von Erwachsenen und die Kardiomyozytenproliferation fördert.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der neonatalen herzmakrophagentransplantation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Bilder der Makrophagenisolation. A) Die Herzen sind in kleine Stücke geschnitten. B)Die Mausherzen sind dissoziiert. C)Die Suspension wird filtriert und in ein 15 mL Zentrifugenrohr überführt. D) Die Anzahl der neonatalen Herzmakrophagen wird berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Neonatale kardiale Makrophagentransplantation fördert die Herzregeneration bei Erwachsenen. A) (Links) Immunfluoreszenzbilder zeigen die proliferativen Kardiomyozyten (Pfeil, pH3 grün, α-Actinin rot). (Rechts) Statistische Analysen zeigen, dass die Kardiomyozytenproliferation nach einer Makrophagentransplantation zunimmt. B) (Links) Echokardiogrammbilder zeigen die Herzfunktion bei erwachsenen Mäusen 1 Monat nach Myokardinfarkt. (Rechts) Statistische Analysen zeigen, dass die Herzfunktion nach einer Makrophagentransplantation verbessert ist. C)Massons Färbung zeigt den infarktierten Bereich bei erwachsenen Mäusen 1 Monat nach Myokardinfarkt. (Rechts) Statistische Analysen zeigen, dass die infarkte Fläche nach Mφ, Makrophagentransplantation, reduziert ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Hier bieten wir einen effektiven Ansatz zur Vorbereitung, zum Erwerb und zur Transplantation neonataler Herzmakrophagen, um die Herzregeneration erwachsener Mäuse zu fördern.
Die apikale Resektion ist eine einfache und effektive Operation zur Stimulierung der Herzregeneration. Wir haben die Details der apikalen Resektion optimiert, um die maximale Überlebensrate der an der Operation beteiligten Tiere zu gewährleisten10. Die Anästhesiezeit sollte nicht länger als 3 Minuten sein, was zu einem durch Unterkühlung induzierten Tod führt, oder kürzer als 2 Minuten, was während der Operation zu übermäßigen Blutungen führen würde. Die Standard-Apikalresektion sollte etwa 1,5 mm Durchmesser des Apexgewebes amputieren. Der Zweck der Operation hier war es jedoch, die reichliche Makrophageninfiltration während des Herzregenerationsprozesses zu stimulieren. Eine Resektion von weniger als 1,5 mm Durchmesser war akzeptabel, da sie gleichzeitig eine maximale Überlebensrate und eine effektive Makrophagenrekrutierung garantieren konnte. Nur die Geschicklichkeit des Bedieners beeinflusste die Überlebensrate, und die operierten Mäuse konnten die verlängerte Operationsdauer nicht überleben. Der Bediener sollte den gesamten Vorgang innerhalb von 5 Minuten abschließen.
In unserer früheren Studie fanden wir heraus, dass eine akute Entzündung die Regeneration des neonatalen Herzens förderte. Intramyokardiale Mikroinjektion von immunogenen Zymosan-A-Partikeln in das herz der neonatalen Maus könnte die Proliferation von Kardiomyozyten fördern6. Vor kurzem behaupteten Molkentin et al., dass die Makrophageninfiltration, die durch intrakardiale Injektion von Zymosan A, Zelltrümmern und gefrier- / taugetöteten Zellen stimuliert wird, die Herzreparatur fördern kann, was bestätigt, dass akute Entzündungen und Makrophagen für die Herzreparatur unerlässlich sind und nicht Stammzellen, die sich in Kardiomyozytendifferenzieren 11. Sadek et al.5 berichteten, dass Makrophagen die Regeneration des neonatalen Herzens durch Angiogenese fördern könnten. Unsere jüngste Studie ergab, dass die neonatale kardiale Makrophageninjektion die Herzregeneration bei Erwachsenen fördern und die Fähigkeit der Kardiomyozytenproliferation bei Erwachsenen erhöhen könnte1,7. Die neonatale kardiale Makrophagentransplantation könnte eine vielversprechende Strategie zur Förderung der Herzregeneration erwachsener Mäuse sein. Hier stellen wir die Protokolle vor, um mehr Forschern bei der regenerativen Anwendungsentwicklung und Erforschung von Herzregenerationsmechanismen zu helfen.
Disclosures
Keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Chinese Academy of Medical Sciences Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS, 2016-I2M-1-015), dem National Key Research and Development Project of China (2019YFA0801500), der National Natural Science Foundation of China (NSFC: 81970243, 81770308), der Beijing Natural Science Foundation (7172183, 7182140) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse alpha actinin | Abcam | Ab9465 | |
| Anti-phospho-Histone H3 | Millipore | 06-570 | |
| Anti-rabbit Aurora B | Abcam | Ab239837 | |
| Anti-rabbit Ki67 | Abcam | Ab15580 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany | N/A | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21137 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit | Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany | 130-098-373 |
References
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