Isolamento, Cultura e Engenharia Genética de Células Epiteliais de Pigmento Primário mamífero para terapia genética não viral

Summary

Aqui, é apresentado um protocolo para isolar e transfetar células epiteliais de íris primária e pigmento da retina de vários mamíferos (ratos, ratos, coelhos, suínos e bovinos). O método é ideal para estudar abordagens de terapia genética ocular em várias configurações para análises ex vivo e estudos in vivo transferíveis para humanos.

Abstract

A degeneração macular relacionada à idade (DAM) é a causa mais frequente de cegueira em pacientes > 60 anos, afetando ~30 milhões de pessoas em todo o mundo. A APA é uma doença multifatorial influenciada por fatores ambientais e genéticos, que levam ao comprometimento funcional da retina devido à degeneração celular epitelial do pigmento da retina (RPE), seguida pela degradação do fotorreceptor. Um tratamento ideal incluiria o transplante de células de RPE saudáveis que secretam fatores neuroprotetores para prevenir a morte celular de RPE e a degeneração do fotorreceptor. Devido às semelhanças funcionais e genéticas e à possibilidade de uma biópsia menos invasiva, o transplante de células epiteliais de pigmento de íris (IPE) foi proposto como um substituto para o RPE degenerado. A secreção de fatores neuroprotetores por um baixo número de células subretinamente transplantadas pode ser alcançada pela transfecção mediada pela Transposon -mígio com genes codificados para o fator derivado do epitélio pigmento (PEDF) e/ou pelo fator estimulante da colônia de macrófago granulocyte (GM-CSF). Estabelecemos o isolamento, a cultura e a transfecção mediada por SB100Xde células RPE e IPE de várias espécies, incluindo roedores, suínos e bovinos. Globos são explantados e a córnea e as lentes são removidas para acessar a íris e a retina. Usando uma espátula personalizada, as células IPE são removidas da íris isolada. Para colher células RPE, pode ser necessária uma incubação de trippsina, dependendo da espécie. Em seguida, usando espátula personalizada rpe, as células são suspensas em média. Após a semeadura, as células são monitoradas duas vezes por semana e, após atingirem a confluência, transfectadas pela eletroporação. Integração genética, expressão, secreção de proteínas e função foram confirmadas por qPCR, WB, ELISA, imunofluorescência e ensaios funcionais. Dependendo da espécie, 30.000-5 milhões (RPE) e 10.000-1,5 milhões (IPE) podem ser isoladas por olho. Células geneticamente modificadas apresentam uma superexpressão significativa de PEDF/GM-CSF com a capacidade de reduzir o estresse oxidativo e oferece um sistema flexível para análises ex vivo e estudos in vivo transferíveis para humanos para desenvolver abordagens de terapia genética ocular.

Introduction

Nosso grupo está focando no desenvolvimento de abordagens regenerativas para tratar a degeneração neuroretinal, ou seja, AMD, por terapia genética não viral baseada em RPE e IPE. O estabelecimento pré-clínico de tais terapias requer modelos in vitro transferíveis aos seres humanos. Assim, o objetivo do estudo aqui apresentado é entregar protocolos para o isolamento, cultura e engenharia genética das células RPE e IPE primárias. A lógica para estabelecer o isolamento das células de Pe de múltiplas espécies é confirmar robustamente a segurança e a eficiência da abordagem e aumentar sua reprodutibilidade e transferênciabilidade. A linha celular humana arpe-19 disponível difere das células primárias (por exemplo, elas são menos pigmentadas) e, portanto, é apenas de valor limitado para análises pré-clínicas¹. Além disso, as células não-humanas dos mamíferos podem ser adquiridas por menor custo e em maiores quantidades; o tecido doador humano pode ser obtido de vários Bancos de Olhos, mas a disponibilidade é limitada e cara. Finalmente, novos Medicamentos de Terapia Avançada (ATMP, ou seja, células, tecidos ou Medicamentos de Terapia Genética) precisam ser aplicados em pelo menos duas espécies diferentes antes de serem testados em pacientes e esses estudos in vivo solicitam a preparação de transplantes de células alergênicas.

As doenças neurodegenerativas da retina são a principal causa de cegueira em países industrializados, compreendendo doenças comuns como a DAM, bem como doenças raras como a retinite pigmentosa, na qual a morte das células da retina eventualmente leva à cegueira. As células RPE, fotorreceptor e células gânglios da retina (RGC) podem, em alguns casos, ser, mas atualmente não há terapias curativas disponíveis. Os ATMPs oferecem o potencial de corrigir defeitos genéticos, integrar genes terapêuticos ou substituir células degeneradas, possibilitando assim o desenvolvimento de terapias regenerativas e curativas para doenças como a AMD; 13 terapias genéticas já receberam aprovação de marketing, incluindo uma terapia para tratar a degeneração da retina associada à mutação RPE65^2,3. Entre os idosos (>60 anos), ~30 milhões de pessoas em todo o mundo são afetadas por nevasculares (nvAMD) ou amd⁴(aAMD) avascular (aAMD). Ambas as formas são induzidas por gatilhos associados à idade, incluindo dano oxidativo, comprometimento da função e perda de células RPE seguidas de degradação fotorreceptora, entre outras (por exemplo, alelos de risco genético, tabagismo, hipertensão)^5,6. No nvAMD, a patogênese é agravada por um desequilíbrio de fatores angiogênicos e anti-angiogênicos em favor do Fator de Crescimento Endotelial Vascular Angiogênico (VEGF) que induz a neovascularização choroidal (CNV). Até o momento, apenas o nvAMD é tratável por injeções intravitreales mensais de inibidores da proteína VEGF para suprimir o CNV; ainda não há tratamento eficaz disponível para aAMD^6,7.

Vários estudos avaliaram terapias baseadas em células para substituir a terapia anti-VEGF: estudos feitos por Binder et al., em que células de RPE recém-colhidas foram transplantadas em pacientes com nAMD^8,9,10, mostraram melhora visual moderada, mas apenas um pequeno grupo de pacientes atingiu uma acuidade visual final alta o suficiente para permitir a leitura. Recentemente, um estudo clínico de fase I utilizou um patch RPE derivado de células-tronco embrionárias para tratar a AMD com resultados promissores; ou seja, eficácia, estabilidade e segurança do patch RPE por até 12 meses em 2 dos 10 pacientes tratados¹¹. Além disso, vários grupos publicaram estudos nos quais as manchas de membrana-coroide autólogas de RPE-Bruch foram colhidas da retina periférica e transplantadas para a mácula^12,13,14; e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) foram geradas para transplante¹⁵. Para a AAMD, anticorpos voltados para a via complementar foram testados em ensaios clínicos^6,16 e um estudo de fase I utilizando uma única injeção intravitareal de um vetor viral associado ao Adeno (AAV) codificando o gene para o fator CD59 (AAVCAGsCD59) em pacientes com atrofia geográfica (GA) foi concluída¹⁷; o estudo da fase II começou recentemente e tem como objetivo recrutar 132 pacientes com aAMD avançado e avaliar o resultado aos 2 anos após a intervenção¹⁸. Finalmente, o grupo de estudo FocuS iniciou um ensaio clínico multicêntrico de fase I/II avaliando a segurança, a resposta de dose e a eficácia de um vetor AAV não replicante recombinante codificando um fator de complemento humano¹⁹.

Principalmente, o objetivo de uma terapia regenerativa de AMD é o transplante de células RPE funcionais, que foram danificadas ou perdidas. No entanto, as células IPE e RPE compartilham muitas semelhanças funcionais e genéticas (por exemplo, fagocitose e metabolismo retinol), e como as células IPE são mais viáveis colhidas, elas foram propostas como substitutas de RPE²⁰. Embora tenha sido demonstrado anteriormente que o transplante de células IPE atrasa a degeneração fotorreceptora nos modelos^{animais 21,22} e estabiliza a função visual em pacientes com nvAMD em estágio terminal, não foi observada melhora significativa nesses pacientes²³. A falta de eficácia pode ser devido ao baixo número de células transplantadas e/ou ao desequilíbrio de fatores neuroprotetores da retina. Uma abordagem alternativa seria transplantar células epiteliais de pigmento transfectados que superexpressem fatores neuroprotetores para restaurar a homeostase da retina, manter células RPE remanescentes e proteger fotorreceptores e RGCs da degeneração. Consequentemente, propomos uma nova terapia que inclua o transplante de células funcionais de RPE ou IPE que passaram por engenharia genética para segregar proteínas neuroprotetoras e anti-angiogênicas, como PEDF, GM-CSF ou fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGFs). A vantagem de desenvolver e analisar essa abordagem em várias espécies em vez de usar uma linha celular, apenas uma espécie ou tecido humano é: 1) maior reprodutibilidade e transferência dos resultados, como mostram inúmeros estudos realizados em laboratórios independentes e diferentes espécies^1,24,25; 2) as células suínas ou bovinas são factíveis descartáveis sem o sacrifício de animais adicionais; 3) a disponibilidade de células especialmente suínas e bovinas permite que grandes séries de testes produzam resultados robustos; 4) o conhecimento para isolar, cultura e modificar geneticamente células dos modelos mais utilizados permite análises in vivo em múltiplas espécies^24,25,26 e, portanto, oferece uma melhor relação risco-benefício para os primeiros pacientes tratados; 5) a flexibilidade do protocolo apresentado permite seu uso em diversos modelos e configurações experimentais e para todas as terapias baseadas em células oculares com e sem engenharia genética. Em contraste, técnicas alternativas como linhas celulares ou tecido humano são apenas de transferência limitada e/ou capacidade de descarte limitada. Linhas celulares como o ARPE-19 são ideais para experimentos preliminares; no entanto, a baixa pigmentação e a alta proliferação diferem significativamente das células primárias¹. As células RPE e IPE, isoladas do tecido doador humano, oferecem uma fonte preciosa para experimentos in vitro transferíveis; no entanto, obtemos tecido humano de um Banco de Olhos AMERICANO-Americano, o que significa que o tecido tem pelo menos dois dias de idade (após a enucleação) e requer um transporte longo e caro, mas o tecido doador local não está disponível em quantidades suficientes para uma pesquisa produtiva. A vantagem do uso de células primárias é confirmada por múltiplos estudos de outros grupos^27,28.

Para o desenvolvimento de uma terapia genética não viral baseada em células usando o sistema transposon SB100X para transfecção de células primárias de RPE e IPE com os genes codificados para PEDF e/ou GM-CSF para tratar nvAMD e aAMD,^{respectivamente 29,30,31,32}, estabelecemos pela primeira vez a transfesionamento de células ARPE-19¹ . Em seguida, os protocolos de isolamento e transfecção foram estabelecidos em células primárias bovinas e suínas facilmente acessíveis. Agora, foi estabelecido o isolamento e transfecção de células primárias de RPE e IPE de cinco espécies diferentes, desde pequenos (como camundongos) até grandes mamíferos (como gado). Foi confirmado em células primárias de RPE e IPE derivadas de olhos de doadores humanos³⁰. A produção compatível com boas práticas de fabricação (GMP) do ATMP foi validada utilizando tecido doador humano, bem como³³. Finalmente, tanto a segurança quanto a eficiência da abordagem foram avaliadas in vivo em três espécies diferentes para as quais o protocolo foi adaptado: rato, rato e coelho. Na configuração clínica, uma biópsia de íris será colhida do paciente e as células do IPE serão isoladas e transfectadas na sala limpa, antes que as células sejam transplantadas subretinarmente de volta para o mesmo paciente. Todo o processo ocorrerá durante uma única sessão cirúrgica que dura aproximadamente 60 minutos. O desenvolvimento da abordagem terapêutica e a avaliação de sua eficiência solicitaram excelentes modelos in vitro e ex vivo para implementar métodos robustos e eficientes de entrega de genes, analisar a eficiência da entrega de genes, produção de proteínas terapêuticas e efeitos neuroprotetores, e produzir transplantes celulares para testar a abordagem in vivo^{1,24,25,29,30} . Vale ressaltar que a terapia tem a aprovação ética para um ensaio de fase clínica Ib/IIa da comissão ética para pesquisa do Cantão de Genebra (nº 2019-00250) e atualmente os últimos dados pré-clínicos solicitados para autorização pelas autoridades reguladoras suíças são coletados usando o protocolo apresentado. Nesse sentido, os dados pré-clínicos do In Vivo demonstraram uma redução significativa na CNV e excelente segurança^24,25,31.

Aqui, descreve-se o isolamento e a cultura das células RPE/IPE de bovinos, suínos, coelhos, ratos e camundongos, e o uso do sistema transposon integrativo SB100X combinado com a eletroporação como um método eficiente de entrega de genes. Particularmente, as células pe primárias foram transfectadas para superexpressar PEDF e GM-CSF. A coleta desses protocolos permite que os estudos in vitro e in vivo sejam realizados em todas as fases pré-clínicas do desenvolvimento do ATMP. Além disso, a configuração tem potencial para ser adaptada a outros genes de interesse e doenças.

Protocol

Os protocolos em que os animais estavam envolvidos foram realizados por pessoal certificado e após autorização do Cantonal Département de la sécurité, de l’emploi et de la santé (DSES), Domaine de l’expérimentation animale de Genebra, Suíça, e de acordo com a Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmica e Visão (aprovação sem aprovação). GE/94/17). Ratos adultos e saudáveis da Noruega, camundongos C57BL/6 e coelhos brancos neozelandeses foram eutanizados por uma overdose de pentobarbital …

Representative Results

Isolamento de PE de diferentes espécies de mamíferosUtilizando os protocolos acima mencionados, as células IPE e RPE foram isoladas com sucesso e cultivadas a partir de cinco espécies diferentes. O número de células obtidas a partir de cada procedimento depende da espécie e tamanho do olho (Tabela 1). Como mostrado na Figura 1,as células mostram morfologia e pigmentação típica das células pe (exceto para as células de coelho mostradas, deriv…

Discussion

Ter métodos padronizados para isolar e cultivar células de PE é fundamental no desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para doenças degenerativas da retina. Com os protocolos aqui apresentados, as células pe podem ser isoladas com sucesso de diferentes espécies e cultivadas por longos períodos (até agora, a cultura mais longa foi mantida por 2 anos^1,38); tipicamente células pe morfologia, pigmentação e função foi observada<strong class="xfi…

Materials

12-well plates	Corning	353043
24-well plates	Corning	353047
48-well plates	ThermoFisher Scientific	150687
6-well plate	Greiner	7657160
Betadine	Mundipharma
Bonn micro forceps flat
Colibri forceps (sterile)
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay	Promega	G9291
DMEM/Ham`s F12	Sigma-Aldrich	D8062
Drape (sterile)	Mölnlycke Health Care	800530
Electroporation buffer 3P.14	3P Pharmaceutical
FBS	Brunschwig	P40-37500
Forceps (different size) (sterile)
Gauze compress	PROMEDICAL AG	25403
NaCl (0.9%)	Laboratorium Dr. Bichsel AG	1000090
Needle (18G)	Terumo	TER-NN1838R
Neon Transfection kit 10 µL	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Neon Transfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000S
Neubauer chamber	Marienfeld-superior	640010
Pasteur pipette (fire-polish)	Witeg	4100150
PBS 1X	Sigma-Aldrich	D8537
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)	Ospedalia AG	31408025
Petri dish	ThermoFisher Scientific	150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-Venus			Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie
pSB100X (250 ng/µL)			Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-Venus			Johnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Cloned in our lab
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Pastor et al., 2018
scarpel no. 10	Swann-Morton	501
scarpel no. 11	Swann-Morton	503
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Tali Image-Based Cytometer	ThermoFisher Scientific	T10796
Trypsin 0.25%	ThermoFisher Scientific	25050014
Trypsin 5%/EDTA 2%	Sigma-Aldrich	T4174
Vannas spring scissors curved (sterile)