Isolatie, kweek en genetische manipulatie van primaire pigmentepitheelcellen van zoogdieren voor niet-virale gentherapie

Summary

Hier wordt een protocol gepresenteerd om primaire iris- en retinale pigmentepitheelcellen van verschillende zoogdieren (muizen, ratten, konijnen, varkens en runderen) te isoleren en te transfecteren. De methode is bij uitstek geschikt om oculaire gentherapiebenaderingen te bestuderen in verschillende opstellingen voor ex vivo analyses en in vivo studies die overdraagbaar zijn op mensen.

Abstract

Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) is de meest voorkomende oorzaak van blindheid bij patiënten >60 jaar en treft ~ 30 miljoen mensen wereldwijd. AMD is een multifactoriële ziekte die wordt beïnvloed door omgevings- en genetische factoren, die leiden tot functionele stoornissen van het netvlies als gevolg van retinale pigmentepitheel (RPE) celdegeneratie gevolgd door afbraak van fotoreceptoren. Een ideale behandeling zou de transplantatie van gezonde RPE-cellen omvatten die neuroprotectieve factoren afscheiden om RPE-celdood en fotoreceptordegeneratie te voorkomen. Vanwege de functionele en genetische overeenkomsten en de mogelijkheid van een minder invasieve biopsie, werd de transplantatie van irispigmentepitheelcellen (IPE) voorgesteld als vervanging voor de gedegenereerde RPE. Secretie van neuroprotectieve factoren door een laag aantal subretinaal getransplanteerde cellen kan worden bereikt door Doornroosje (SB100X)transposon-gemedieerde transfectie met genen die coderen voor de pigmentepitheel-afgeleide factor (PEDF) en / of de granulocyt macrofaag-kolonie stimulerende factor (GM-CSF). We hebben de isolatie, cultuur en SB100X-gemedieerdetransfectie van RPE- en IPE-cellen van verschillende soorten vastgesteld, waaronder knaagdieren, varkens en runderen. Bollen worden geëxplanteerd en het hoornvlies en de lens worden verwijderd om toegang te krijgen tot de iris en het netvlies. Met behulp van een op maat gemaakte spatel worden IPE-cellen uit de geïsoleerde iris verwijderd. Om RPE-cellen te oogsten, kan een trypsine-incubatie nodig zijn, afhankelijk van de soort. Vervolgens worden met behulp van RPE-aangepaste spatel cellen in medium gesuspendeerd. Na het zaaien worden de cellen twee keer per week gecontroleerd en, na het bereiken van confluentie, getransfecteerd door elektroporatie. Genintegratie, expressie, eiwitsecretie en functie werden bevestigd door qPCR, WB, ELISA, immunofluorescentie en functionele assays. Afhankelijk van de soort kunnen 30.000-5 miljoen (RPE) en 10.000-1,5 miljoen (IPE) cellen per oog worden geïsoleerd. Genetisch gemodificeerde cellen vertonen een significante PEDF/GM-CSF overexpressie met het vermogen om oxidatieve stress te verminderen en bieden een flexibel systeem voor ex vivo analyses en in vivo studies die overdraagbaar zijn op mensen om oculaire gentherapiebenaderingen te ontwikkelen.

Introduction

Onze groep richt zich op de ontwikkeling van regeneratieve benaderingen voor de behandeling van neuroretinale degeneratie, d.w.z. AMD, door RPE- en IPE-gebaseerde niet-virale gentherapie. De preklinische oprichting van dergelijke therapieën vereist in vitro modellen die overdraagbaar zijn op de mens. Het doel van de hier gepresenteerde studie is dus om protocollen te leveren voor de isolatie, cultuur en genetische manipulatie van primaire RPE- en IPE-cellen. De reden om de isolatie van PE-cellen van meerdere soorten vast te stellen, is om de veiligheid en efficiëntie van de aanpak robuust te bevestigen en de reproduceerbaarheid en overdraagbaarheid ervan te vergroten. De beschikbare menselijke RPE-cellijn ARPE-19 verschilt van primaire cellen (ze zijn bijvoorbeeld minder gepigmenteerd) en is daarom slechts van beperkte waarde voor preklinische analyses¹. Bovendien kunnen niet-menselijke zoogdiercellen worden gekocht voor minder kosten en in grotere hoeveelheden; menselijk donorweefsel kan worden verkregen bij verschillende oogbanken, maar de beschikbaarheid is beperkt en duur. Ten slotte moeten nieuwe geneesmiddelen voor geavanceerde therapie (ATMP, d.w.z. cel-, weefsel- of gentherapiegeneesmiddel) in ten minste twee verschillende soorten worden toegepast voordat ze bij patiënten worden getest en deze in vivo studies vragen om de voorbereiding van allogene celtransplantaties.

Retinale neurodegeneratieve ziekten zijn de belangrijkste oorzaak van blindheid in geïndustrialiseerde landen, waaronder veel voorkomende ziekten zoals AMD, evenals zeldzame ziekten zoals retinitis pigmentosa, waarbij de retinale celdood uiteindelijk leidt tot blindheid. RPE-cellen, fotoreceptor en retinale ganglioncellen (RGC) schade kan in sommige gevallen worden vertraagd, maar er zijn momenteel geen curatieve therapieën beschikbaar. ATMP’s bieden het potentieel om gendefecten te corrigeren, therapeutische genen te integreren of gedegenereerde cellen te vervangen, waardoor de ontwikkeling van regeneratieve en curatieve therapieën voor ziekten zoals AMD mogelijk wordt; 13 gentherapieën kregen al goedkeuring voor het op de markt brengen, waaronder een therapie voor de behandeling van RPE65 mutatie-geassocieerde retinale degeneratie^2,3. Onder oudere volwassenen (>60 jaar) worden ~ 30 miljoen mensen wereldwijd getroffen door neovasculaire (nvAMD) of avasculaire (aAMD) AMD⁴. Beide vormen worden geïnduceerd door leeftijdsgebonden triggers, waaronder oxidatieve schade, functiestoornissen en verlies van RPE-cellen gevolgd door fotoreceptordegradatie, onder andere (bijv. Genetische risico-allelen, roken, hypertensie)^5,6. Bij nvAMD wordt de pathogenese verergerd door een onbalans van angiogene en anti-angiogene factoren ten gunste van de angiogene Vasculaire Endotheliale Groeifactor (VEGF) die choroïdale neovascularisatie (CNV) induceert. Tot op heden is alleen nvAMD te behandelen door maandelijkse intravitreale injecties van remmers van het VEGF-eiwit om het CNV te onderdrukken; er is nog geen effectieve behandeling beschikbaar voor aAMD^6,7.

Verschillende studies evalueerden celgebaseerde therapieën om de anti-VEGF-therapie te vervangen: studies uitgevoerd door Binder et al., waarbij vers geoogste autologe RPE-cellen werden getransplanteerd in patiënten met nAMD^8,9,10, toonden matige visuele verbetering, maar slechts een kleine groep patiënten bereikte een uiteindelijke gezichtsscherpte die hoog genoeg was om lezen mogelijk te maken. Onlangs gebruikte een fase I klinische studie een embryonale stamcel-afgeleide RPE-pleister om AMD te behandelen met veelbelovende resultaten; d.w.z. werkzaamheid, stabiliteit en veiligheid van de RPE-pleister gedurende maximaal 12 maanden bij 2 van de 10 behandelde patiënten¹¹. Daarnaast hebben verschillende groepen studies gepubliceerd waarin autologe RPE-Bruch’s membraan-vaatvliespleisters werden geoogst van het perifere netvlies en getransplanteerd naar de macula^12,13,14; en geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide RPE-pleisters werden gegenereerd voor^{transplantatie 15}. Voor aAMD zijn antilichamen gericht op de complementroute getest in klinische onderzoeken^6,16 en een fase I-studie met behulp van een enkele intravitreale injectie van een adeno-geassocieerde virale (AAV) vector die codeert voor het gen voor de factor CD59 (AAVCAGsCD59) bij patiënten met geografische atrofie (GA) werd voltooid¹⁷; de fase II-studie is onlangs gestart en heeft tot doel 132 patiënten met gevorderde aAMD te werven en de uitkomst 2 jaar na de interventie te evalueren¹⁸. Ten slotte is de FocuS-studiegroep begonnen met een fase I / II multicenter klinische studie ter evaluatie van de veiligheid, dosisrespons en werkzaamheid van een recombinante niet-replicerende AAV-vector die codeert voor een humane complementfactor¹⁹.

In de eerste plaats is het doel van een regeneratieve AMD-therapie de transplantatie van functionele RPE-cellen, die beschadigd of verloren zijn gegaan. IPE- en RPE-cellen delen echter veel functionele en genetische overeenkomsten (bijv. Fagocytose en retinolmetabolisme), en omdat IPE-cellen haalbaarder worden geoogst, zijn ze voorgesteld als een RPE-substituut²⁰. Hoewel eerder is aangetoond dat de IPE-celtransplantatie de degeneratie van fotoreceptoren in diermodellen^{vertraagt 21,22} en de visuele functie stabiliseert bij patiënten met nvAMD in het eindstadium, werd bij deze patiënten geen significante verbetering waargenomen²³. Het gebrek aan werkzaamheid kan te wijten zijn aan het lage aantal getransplanteerde cellen en / of de onbalans van neuroprotectieve retinale factoren. Een alternatieve benadering zou zijn om getransfecteerde pigmentepitheelcellen te transplanteren die neuroprotectieve factoren overexpressie hebben om retinale homeostase te herstellen, resterende RPE-cellen te behouden en fotoreceptoren en RGC’s te beschermen tegen degeneratie. Daarom stellen we een nieuwe therapie voor die de transplantatie omvat van functionele RPE- of IPE-cellen die genetische manipulatie hebben ondergaan om neuroprotectieve en anti-angiogene eiwitten, zoals PEDF, GM-CSF of insuline-achtige groeifactoren (IGF’s) uit te scheiden. Het voordeel van het ontwikkelen en analyseren van deze aanpak in verschillende soorten in plaats van het gebruik van een cellijn, slechts één soort of menselijk weefsel is: 1) verhoogde reproduceerbaarheid en overdraagbaarheid van de resultaten zoals aangetoond door talrijke studies gerealiseerd in onafhankelijke laboratoria en verschillende soorten^1,24,25; 2) varkens- of rundercellen zijn mogelijk wegwerpbaar zonder dat er extra dieren worden opgeofferd; 3) de beschikbaarheid van met name varkens- en rundercellen maakt het mogelijk grote testreeksen om robuuste resultaten te produceren; 4) de kennis om cellen uit de meest gebruikte modellen te isoleren, te kweken en genetisch te modificeren maakt in vivo analyses in meerdere soorten^24,25,26 mogelijk en biedt zo een verbeterde risico-batenverhouding voor de eerste behandelde patiënten; 5) de flexibiliteit van het gepresenteerde protocol maakt het gebruik ervan mogelijk in verschillende modellen en experimentele opstellingen en voor alle op oculaire cellen gebaseerde therapieën met en zonder genetische manipulatie. Alternatieve technieken zoals cellijnen of menselijk weefsel hebben daarentegen slechts een beperkte overdraagbaarheid en/of beperkte disposeerbaarheid. Cellijnen zoals de ARPE-19 zijn ideaal voor voorbereidende experimenten; lage pigmentatie en hoge proliferatie verschillen echter aanzienlijk van primaire cellen¹. RPE- en IPE-cellen, die worden geïsoleerd uit menselijk donorweefsel, bieden een kostbare bron voor overdraagbare in vitro experimenten; we verkrijgen echter menselijk weefsel van een Amerikaans-Amerikaanse oogbank, wat betekent dat het weefsel minstens twee dagen oud is (na enucleatie) en een lang en duur transport vereist, maar lokaal donorweefsel is niet in voldoende hoeveelheden beschikbaar voor een productief onderzoek. Het voordeel van het gebruik van primaire cellen wordt bevestigd door meerdere studies uit andere groepen^27,28.

Voor de ontwikkeling van een op cellen gebaseerde niet-virale gentherapie met behulp van het SB100X transposonsysteem voor het transfecteren van primaire RPE- en IPE-cellen met de genen die coderen voor PEDF en / of GM-CSF voor de behandeling van nvAMD en aAMD, respectievelijk^29,30,31,32, hebben we eerst de transfectie van ARPE-19-cellen vastgesteld¹ . Vervolgens werden de isolatie- en transfectieprotocollen vastgesteld in gemakkelijk toegankelijke primaire cellen van runderen en varkens. Nu is de isolatie en transfectie van primaire RPE- en IPE-cellen van vijf verschillende soorten vastgesteld, van kleine (als muis) tot grote zoogdieren (als vee). Het werd bevestigd in primaire RPE- en IPE-cellen afgeleid van menselijke donorogen³⁰. De good manufacturing practices (GMP)-conforme productie van het ATMP werd gevalideerd met behulp van menselijk donorweefsel^33. Ten slotte werden zowel de veiligheid als de efficiëntie van de aanpak in vivo beoordeeld bij drie verschillende soorten waarvoor het protocol is aangepast: muis, rat en konijn. In de klinische opstelling zal een irisbiopsie van de patiënt worden geoogst en IPE-cellen zullen worden geïsoleerd en getransfecteerd in de cleanroom, voordat de cellen subretinaal terug in dezelfde patiënt worden getransplanteerd. Het hele proces vindt plaats tijdens een enkele chirurgische sessie die ongeveer 60 minuten duurt. De ontwikkeling van de behandelingsaanpak en de evaluatie van de efficiëntie ervan vroegen om uitstekende in vitro en ex vivo modellen om robuuste en efficiënte genafgiftemethoden te implementeren, om de efficiëntie van genafgifte, therapeutische eiwitproductie en neuroprotectieve effecten te analyseren, en om celtransplantaties te produceren om de aanpak in vivote testen^{1,24,25,29,30} . Het is vermeldenswaard dat de therapie de ethische goedkeuring heeft voor een klinische fase Ib / IIa-studie van de ethische commissie voor onderzoek van het kanton Genève (nr. 2019-00250) en momenteel worden de laatste preklinische gegevens die door Zwitserse regelgevende instanties om toestemming worden gevraagd, verzameld met behulp van het gepresenteerde protocol. In dit verband toonden preklinische in vivo gegevens een significante vermindering van CNV en uitstekende veiligheid^24,25,31.

Hier wordt de isolatie en kweek van RPE/IPE-cellen van runderen, varkens, konijnen, ratten en muizen en het gebruik van het integratieve SB100X transposonsysteem in combinatie met elektroporatie als een efficiënte genafgiftemethode beschreven. Met name primaire PE-cellen werden getransfecteerd om PEDF en GM-CSF te overexpressie te maken. De verzameling van deze protocollen maakt het mogelijk om de in vitro en in vivo studies uit te voeren in alle preklinische fasen van ATMP-ontwikkeling. Bovendien heeft de opstelling de potentie om aangepast te worden aan andere genen en ziekten.

Protocol

De protocollen waarbij dieren betrokken waren, werden uitgevoerd door gecertificeerd personeel en na toestemming van het kantonnale Département de la sécurité, de l’emploi et de la santé (DSES), Domaine de l’expérimentation animale uit Genève, Zwitserland, en volgens de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visionair onderzoek (goedkeuringsnr. GE/94/17). Volwassen gezonde bruine fijnratten, C57BL /6-muizen en Nieuw-Zeelandse witte konijnen werden geëuthanaseerd door een overdosis Pentobar…

Representative Results

PE-isolatie van verschillende zoogdiersoortenMet behulp van de bovengenoemde protocollen werden IPE- en RPE-cellen met succes geïsoleerd en gekweekt van vijf verschillende soorten. Het aantal cellen dat bij elke procedure wordt verkregen, is afhankelijk van de soort en de grootte van het oog(tabel 1). Zoals weergegeven in figuur 1,vertonen cellen typische PE-celmorfologie en pigmentatie (behalve voor getoonde konijnencellen, afgeleid van albino New Zeal…

Discussion

Het hebben van gestandaardiseerde methoden om PE-cellen te isoleren en te kweken is van fundamenteel belang bij het ontwikkelen van nieuwe therapiebenaderingen voor retinale degeneratieve ziekten. Met de hier gepresenteerde protocollen kunnen PE-cellen met succes worden geïsoleerd van verschillende soorten en gedurende lange perioden worden gekweekt (tot nu toe werd de langste cultuur gedurende 2 jaar^{gehandhaafd 1,38}); typische PE-celmorfologie, pigmentatie en f…

Materials

12-well plates	Corning	353043
24-well plates	Corning	353047
48-well plates	ThermoFisher Scientific	150687
6-well plate	Greiner	7657160
Betadine	Mundipharma
Bonn micro forceps flat
Colibri forceps (sterile)
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay	Promega	G9291
DMEM/Ham`s F12	Sigma-Aldrich	D8062
Drape (sterile)	Mölnlycke Health Care	800530
Electroporation buffer 3P.14	3P Pharmaceutical
FBS	Brunschwig	P40-37500
Forceps (different size) (sterile)
Gauze compress	PROMEDICAL AG	25403
NaCl (0.9%)	Laboratorium Dr. Bichsel AG	1000090
Needle (18G)	Terumo	TER-NN1838R
Neon Transfection kit 10 µL	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Neon Transfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000S
Neubauer chamber	Marienfeld-superior	640010
Pasteur pipette (fire-polish)	Witeg	4100150
PBS 1X	Sigma-Aldrich	D8537
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)	Ospedalia AG	31408025
Petri dish	ThermoFisher Scientific	150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-Venus			Pastor et al., 2018. Kindly provided by Prof. Scherman and Prof. Marie
pSB100X (250 ng/µL)			Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-Venus			Johnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Cloned in our lab
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL)			Pastor et al., 2018
scarpel no. 10	Swann-Morton	501
scarpel no. 11	Swann-Morton	503
Sharp-sharp tip curved Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Sharp-sharp tip straight Extra Fine Bonn Scissors (sterile)
Tali Image-Based Cytometer	ThermoFisher Scientific	T10796
Trypsin 0.25%	ThermoFisher Scientific	25050014
Trypsin 5%/EDTA 2%	Sigma-Aldrich	T4174
Vannas spring scissors curved (sterile)