Erzeugung und Expansion menschlicher Kardiomyozyten aus mononukleären Zellen des patientenperipheren Blutes
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur robusten Erzeugung und Erweiterung menschlicher Kardiomyozyten aus mononukleären Zellen des patienteneigenen peripheren Blutes vor.
Abstract
Die Generierung patientenspezifischer Kardiomyozyten aus einer einzigen Blutentnahme hat ein enormes Interesse an der Präzisionsmedizin bei Herz-Kreislauf-Erkrankungen geweckt. Die kardiale Differenzierung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) wird durch definierte Signalwege moduliert, die für die embryonale Herzentwicklung essentiell sind. Zahlreiche kardiale Differenzierungsmethoden auf 2-D- und 3D-Plattformen wurden mit unterschiedlichen Wirkungsgraden und Kardiomyozytenausbeute entwickelt. Dies hat Ermittler außerhalb des Feldes verwirrt, da die Vielfalt dieser Methoden schwer zu verfolgen sein kann. Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll vor, das eine robuste Erzeugung und Erweiterung von patientenspezifischen Kardiomyozyten aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) ausarbeitet. Wir beschreiben zunächst ein hocheffizientes iPSC-Reprogrammierungsprotokoll aus der Blutprobe eines Patienten unter Verwendung von Sendai-Virusvektoren ohne Integration. Wir beschreiben dann eine kleinmolekülvermittelte Monolayer-Differenzierungsmethode, die aus den meisten menschlichen iPSC-Linien robust schlagende Kardiomyozyten herstellen kann. Darüber hinaus wird ein skalierbares Kardiomyozyten-Expansionsprotokoll unter Verwendung eines kleinen Moleküls (CHIR99021) eingeführt, das von Patienten abgeleitete Kardiomyozyten für industrielle und klinische Anwendungen schnell erweitern könnte. Am Ende werden detaillierte Protokolle zur molekularen Identifizierung und elektrophysiologischen Charakterisierung dieser iPSC-CMs dargestellt. Wir erwarten, dass dieses Protokoll für Anfänger mit begrenztem Wissen über kardiovaskuläre Entwicklung und Stammzellbiologie pragmatisch ist.
Introduction
Die Entdeckung humaner induzierter pluripotenter Stammzellen hat die moderne kardiovaskuläre Medizin revolutioniert1,2. Menschliche iPS-Zellen sind in der Lage, sich selbst zu erneuern und alle Zelltypen im Herzen zu erzeugen, einschließlich Kardiomyozyten, Endothelzellen, glatte Muskelzellen und kardiale Fibroblasten. Patienten-iPSC-abgeleitete Kardiomyozyten (iPSC-CMs) können als unbestimmte Ressourcen für die Modellierung genetisch vererbbarer Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVDs) und die Prüfung der kardialen Sicherheit für neue Medikamente dienen3. Insbesondere sind die iPSC-CMs der Patienten gut aufgestellt, um genetische und molekulare Ätiologien von CVDs zu untersuchen, die von Defekten in Kardiomyozyten wie dem long QT-Syndrom4 und der dilatativen Kardiomyopathie (DCM)5abgeleitet sind. In Kombination mit DER CRISPR/Cas9-vermittelten Genom-Editierung haben patienteneigene iPSC-CMs einen beispiellosen Weg eröffnet, um die komplexe genetische Basis von CVDs einschließlich angeborener Herzfehler (KHK) zu verstehen6,7,8. Menschliche iPSC-CMs haben auch das Potenzial gezeigt, als autologe Zellquellen für die Auffüllung des beschädigten Myokards während eines Herzinfarkts zu dienen9. In den letzten Jahren ist es von größter Bedeutung, qualitativ hochwertige humane iPSC-CMs mit definierten Subtypen (Atrial, Ventrikel und Knoten) für die Herzregeneration und Drogentests zu generieren10.
Die kardiale Differenzierung von humanen iPS-Zellen wurde in den letzten zehn Jahren stark vorangetrieben. Differenzierungsmethoden sind von der embryoiden Körper (EB)-basierten spontanen Differenzierung zur chemisch definierten und gerichteten Herzdifferenzierung übergegangen11. Wichtige Signalmoleküle, die für die embryonale Herzentwicklung unerlässlich sind, wie Wnt, BMP, Nodal und FGF, werden manipuliert, um die Differenzierung von Kardiomyozyten aus menschlichen iPS-Zellen zu verbessern10,12. Zu den signifikanten Fortschritten gehören die sequentielle Modulation der Wnt-Signalgebung (Aktivierung gefolgt von Inhibition) für eine robuste Erzeugung von Kardiomyozyten aus menschlichen iPS-Zellen13,14. Chemisch definierte kardiale Differenzierungsrezepte wurden untersucht, um die großtechnische Produktion von schlagenden Kardiomyozyten15,16zuerleichtern,die das Potenzial haben, auf industrielle und klinische Ebene aufgerüstet zu werden. Darüber hinaus wird eine robuste Expansion von frühen humanen iPSC-CMs durch die Exposition gegenüber konstitutiver Wnt-Aktivierung unter Verwendung einer kleinen Chemikalie (CHIR99021)17erreicht. In jüngster Zeit werden subtypspezifische Kardiomyozyten durch Manipulation von Retinsäure (RA) und Wnt-Signalwegen an spezifischen Differenzierungsfenstern während der Kardiomyozyten-Linienverpflichtung von menschlichen iPS-Zellenerzeugt 18,19,20,21,22.
In diesem Protokoll beschreiben wir ein Arbeitsverfahren für die robuste Erzeugung und Proliferation menschlicher CMs, die aus mononukleären Zellen des patienten peripheren Blutes stammen. Wir präsentieren Protokolle für 1) die Reprogrammierung menschlicher PBMCs in iPS-Zellen, 2) die robuste Erzeugung von schlagenden Kardiomyozyten aus menschlichen iPS-Zellen, 3) die schnelle Expansion früher iPSC-CMs, 4) die molekulare Charakterisierung menschlicher iPSC-CMs und 5) die elektrophysiologische Messung menschlicher iPSC-CMs auf Einzelzellebene per Patch clamp. Dieses Protokoll deckt die detaillierten experimentellen Verfahren zur Umwandlung von Patientenblutzellen in schlagende Kardiomyozyten ab.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während der iPSC-Reprogrammierung ist es entscheidend, PBMCs für 1 Woche zu kultivieren, bis sie mit klaren Kernen und Zytoplasma vergrößert werden. Da sich PBMCs nicht vermehren, ist eine geeignete Zellzahl für die virale Transduktion wichtig für eine erfolgreiche iPSC-Reprogrammierung. Die Zellzahl der PBMCs, die Vielzahl der Infektionen (MOI) und der Titer des Virus sollten berücksichtigt und angepasst werden, um die optimalen Transduktionsergebnisse zu erreichen. Für die kardiale Differenzierung ist die anfä…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch den Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), die Additional Ventures AVIF und SVRF Awards (M-T.Z.), die National Institutes of Health (NIH/NHLBI) 1R01HL124245, 1R01HL132520 und R01HL096962 (I.D.) unterstützt. Dr. Ming-Tao Zhao wurde auch durch Startkapital des Abigail Wexner Research Institute am Nationwide Children’s Hospital unterstützt.
Materials
| ABI 7300 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | ||
| Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | Microelectrode Amplifier | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer |
| BD Vacutainer CPT tube | BD Biosciences | 362753 | Blood cell separation tube |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | Sendai virus reprogramming kit |
| Digidata 1200B | Axon Instruments | Acquisition board | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | RNA extraction kit |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
| Essential 8 medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | E8 media for iPSC culture |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-glutamine alternative |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 356231 | Basement membrane matrix |
| iScript cDNA Snythesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| pCLAMP 7.0 | Molecular Devices | Electrophysiology data acquisition & analysis software | |
| Recombinant human EPO | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
| Recombinant human FLT3 | Thermo Fisher Scientific | PHC9414 | |
| Recombinant human IL3 | Peprotech | 200-03 | |
| Recombinant human IL6 | Thermo Fisher Scientific | PHC0065 | |
| Recombinant human SCF | Peprotech | 300-07 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| RPMI 1640 medium, no glucose | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | S36936 | Mounting media |
| StemPro-34 SFM | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | PBMC culture media |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444964 | qPCR master mix |
| TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | A1217703 | CM dissociation solution |
| UltraPure 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | iPSC dissociation solution |
| Y-27632 2HCl | Selleck Chemicals | S1049 |
Riferimenti
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