Generering og udvidelse af humane kardiomyocytter fra patientens perifere blod mononukleare celler
Summary
Her præsenterer vi en protokol til robust at generere og udvide menneskelige kardiomyocytter fra patientens perifere blodmonnukleare celler.
Abstract
Generering patient-specifikke kardiomyocytter fra en enkelt blodprøve har tiltrukket enorm interesse i præcision medicin på hjerte-kar-sygdom. Hjertedifferentiering fra human inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) moduleres ved definerede signalveje, der er afgørende for embryonal hjerteudvikling. Talrige hjertedifferentieringsmetoder på 2D- og 3D-platforme er blevet udviklet med forskellige effektivitetsgevinster og kardiomyocytudbytte. Dette har undret efterforskere uden for feltet, da de mange forskellige af disse metoder kan være vanskelige at følge. Her præsenterer vi en omfattende protokol, der uddyber robust generering og udvidelse af patientspecifikke kardiomyocytter fra perifere blodmonnukleare celler (PBMCs). Vi beskriver først en højeffektiv iPSC-omprogrammeringsprotokol fra en patients blodprøve ved hjælp af sendai-virusvektorer uden integration. Vi beskriver derefter en lille molekylemedieret monolayer differentieringsmetode, der robust kan producere slå kardiomyocytter fra de fleste menneskelige iPSC-linjer. Derudover introduceres en skalerbar kardiomyocyt ekspansionsprotokol ved hjælp af et lille molekyle (CHIR99021), der hurtigt kan udvide patientafledte kardiomyocytter til industrielle og kliniske applikationer. I slutningen er detaljerede protokoller for molekylær identifikation og elektrofysiologisk karakterisering af disse iPSC-CMs afbildet. Vi forventer, at denne protokol er pragmatisk for begyndere med begrænset viden om hjerte-kar-udvikling og stamcellebiologi.
Introduction
Opdagelsen af menneskeskabte pluripotente stamceller har revolutioneret moderne hjerte-kar-medicin1,2. Humane iPSCs er i stand til selvfornyelse og generering af alle celletyper i hjertet, herunder kardiomyocytter, endotelceller, glatte muskelceller og hjertefibroblaster. Patient iPSC-afledte kardiomyocytter (iPSC-CMs) kan tjene som ubestemte ressourcer til modellering genetisk arvelige hjerte-kar-sygdomme (CVD’er) og test af hjertesikkerhed for nye lægemidler3. Især er patient iPSC-CMs godt klar til at undersøge genetiske og molekylære ætiologier af CVD’er, der er afledt af defekter i kardiomyocytter, såsom lange QT syndrom4 og udvidet kardiomyopati (DCM)5. Kombineret med CRISPR/Cas9-medieret genomredigering har patient iPSC-CMs åbnet en hidtil uset vej til at forstå det komplekse genetiske grundlag for CVD’er, herunder medfødte hjertefejl (CHDs)6,7,8. Human iPSC-CMs har også udstillet potentialer til at tjene som autologe celle kilder til genopfyldning af den beskadigede myokardie under et hjerteanfald9. I de senere år er det blevet altafgørende at generere højkvalitets menneskelige iPSC-CMs med definerede undertyper (atrie, ventrikulær og nodal) til hjerteregenerering og lægemiddeltest10.
Hjertedifferentiering fra menneskelige iPSCs har været meget avanceret i det seneste årti. Differentieringsmetoderne er gået fra embryoidkroppen (EB)-baseret spontan differentiering til kemisk defineret og styret hjertedifferentiering11. Centrale signalmolekyler, der er afgørende for embryonal hjerteudvikling, såsom Wnt, BMP, Nodal og FGF, manipuleres for at forbedre kardiomyocytdifferentiering fra humane iPSCs10,12. Væsentlige fremskridt omfatter sekventiel graduering af Wnt-signalering (aktivering efterfulgt af hæmning) for robust generering af kardiomyocytter fra humane iPSC’er13,14. Kemisk definerede hjertedifferentiering opskrifter er blevet undersøgt for at lette storstilet produktion af slå kardiomyocytter15,16, som har potentiale til at blive opgraderet til industriel og klinisk niveau produktion. Desuden opnås en robust udvidelse af tidlige humane iPSC-CMs ved at blive udsat for konstituerende Wnt-aktivering ved hjælp af et lille kemikalie (CHIR99021)17. Senest genereres subtypespecifikke kardiomyocytter gennem manipulation af retinsyre (RA) og Wnt-signalveje ved specifikke differentieringsvinduer under kardiomyocyt-afstamningforpligtelse fra humane iPSCs18,19,20,21,22.
I denne protokol beskriver vi en fungerende procedure for robust generering og spredning af menneskelige DM’er, der stammer fra patientens perifere blodmonnukleare celler. Vi præsenterer protokoller for 1) omprogrammering af menneskelige PBMCs til iPSCs, 2) robust generation af slå kardiomyocytter fra menneskelige iPSCs, 3) hurtig udvidelse af tidlige iPSC-CMs, 4) molekylær karakterisering af menneskelige iPSC-CMs, og 5) elektrofysiologisk måling af humane iPSC-CMs på enkeltcellet niveau ved patch clamp. Denne protokol dækker de detaljerede eksperimentelle procedurer for konvertering af patientens blodlegemer til at slå kardiomyocytter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under iPSC omprogrammering, er det afgørende for kultur PBMCs i 1 uge, indtil de er udvidet med klare kerner og cytoplasma. Da PBMCs ikke formerer sig, er et passende cellenummer til viral transduktion vigtigt for vellykket omprogrammering af iPSC. Celletal af PBMCs, mangfoldighed af infektion (MOI) og titer af virus bør overvejes og justeres for at nå de optimale transduktionsresultater. For hjertedifferentiering er den indledende såningstæthed afgørende for, at iPSCs når over 90% sammenløb den dag, hvor CHIR990…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af American Heart Association (AHA) Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), Yderligere Ventures AVIF og SVRF awards (M-T.Z.), National Institutes of Health (NIH / NHLBI) giver 1R01HL124245, 1R01HL132520 og R01HL096962 (I.D.). Dr. Ming-Tao Zhao blev også støttet af start midler fra Abigail Wexner Research Institute på Nationwide Children’s Hospital.
Materials
| ABI 7300 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | ||
| Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | Microelectrode Amplifier | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer |
| BD Vacutainer CPT tube | BD Biosciences | 362753 | Blood cell separation tube |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | Sendai virus reprogramming kit |
| Digidata 1200B | Axon Instruments | Acquisition board | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | RNA extraction kit |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
| Essential 8 medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | E8 media for iPSC culture |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-glutamine alternative |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 356231 | Basement membrane matrix |
| iScript cDNA Snythesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| pCLAMP 7.0 | Molecular Devices | Electrophysiology data acquisition & analysis software | |
| Recombinant human EPO | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
| Recombinant human FLT3 | Thermo Fisher Scientific | PHC9414 | |
| Recombinant human IL3 | Peprotech | 200-03 | |
| Recombinant human IL6 | Thermo Fisher Scientific | PHC0065 | |
| Recombinant human SCF | Peprotech | 300-07 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| RPMI 1640 medium, no glucose | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | S36936 | Mounting media |
| StemPro-34 SFM | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | PBMC culture media |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444964 | qPCR master mix |
| TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | A1217703 | CM dissociation solution |
| UltraPure 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | iPSC dissociation solution |
| Y-27632 2HCl | Selleck Chemicals | S1049 |
Riferimenti
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
- Hinson, J. T., et al. Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy. Science. 349 (6251), 982-986 (2015).
- Deacon, D. C., et al. Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy. Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).
- Gifford, C. A., et al. Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier. Science. 364 (6443), 865-870 (2019).
- Lo Sardo, V., et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).
- Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
- Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now. Stem Cells. 38, 822-833 (2020).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- Zhao, M. T., et al. Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Lian, X., et al. Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation. Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).
- Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Liang, W., et al. Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Ren, J., et al. Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes. Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).
- Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).
- Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism. Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).
- Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. Determinants of cardiac growth and size. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).
- Campa, V. M., et al. Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).
- Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).
- Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
