Generation och expansion av mänskliga kardiomyocyter från mononukleära celler i patient perifert blod
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att robust generera och expandera mänskliga kardiomyocyter från patientens perifera blod mononukleära celler.
Abstract
Att generera patientspecifika kardiomyocyter från en enda bloddragning har lockat ett enormt intresse för precisionsmedicin på hjärt-kärlsjukdom. Hjärtdifferentiering från humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) moduleras av definierade signalvägar som är väsentliga för embryonal hjärtutveckling. Många hjärt differentiering metoder på 2D och 3D plattformar har utvecklats med olika effektivitet och kardiomyocyter avkastning. Detta har förbryllat utredare utanför fältet eftersom mångfalden av dessa metoder kan vara svår att följa. Här presenterar vi ett omfattande protokoll som utarbetar robust generering och expansion av patientspecifika kardiomyocyter från perifera blod mononukleära celler (PBMCs). Vi beskriver först en högeffektiv iPSC omprogrammering protokoll från en patients blodprov med hjälp av icke-integration Sendai virus vektorer. Vi beskriver sedan en liten molekylmedierad monolayer differentieringsmetod som robust kan producera slå kardiomyocyter från de flesta mänskliga iPSC-linjer. Dessutom introduceras ett skalbart kardiomyocytexpansionsprotokoll med hjälp av en liten molekyl (CHIR99021) som snabbt kan expandera patientbaserade kardiomyocyter för industriella och kliniska tillämpningar. I slutet avbildas detaljerade protokoll för molekylär identifiering och elektrofysiologisk karakterisering av dessa iPSC-CMs. Vi förväntar oss att detta protokoll ska vara pragmatiskt för nybörjare med begränsad kunskap om kardiovaskulär utveckling och stamcellsbiologi.
Introduction
Upptäckten av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller har revolutionerat modern kardiovaskulär medicin1,2. Mänskliga iPSCs kan självförnyelse och generera alla celltyper i hjärtat, inklusive kardiomyocyter, endotelceller, släta muskelceller och hjärtfibblaster. Patient iPSC-härledda kardiomyocyter (iPSC-CMs) kan fungera som obestämda resurser för modellering av genetiskt ärftliga hjärt-kärlsjukdomar (CVD) och testning av hjärtsäkerhet för nya läkemedel3. I synnerhet är patientens iPSC-CMs väl satta för att undersöka genetiska och molekylära etiologier av CVDs som härrör från defekter i kardiomyocyter, såsom långt QT syndrom4 och dilaterad kardiomyopati (DCM)5. I kombination med CRISPR/Cas9-medierad genomredigering har patientens iPSC-CMs öppnat en aldrig tidigare skådad väg för att förstå den komplexa genetiska grunden för CVD inklusive medfödda hjärtfel (CHDs)6,7,8. Mänskliga iPSC-CMs har också uppvisat potentialer att fungera som autologa cellkällor för att fylla på det skadade hjärtmuskelt under en hjärtattack9. Under de senaste åren har det blivit av största vikt att generera högkvalitativa mänskliga iPSC-CMs med definierade undertyper (förmakstyp, ventrikulär och nodal) för hjärtregenerering och drogtestning10.
Hjärtdifferentiering från mänskliga iPSCs har utvecklats kraftigt under det senaste decenniet. Differentieringsmetoderna har gått från embryoidkropp (EB)-baserad spontan differentiering till kemiskt definierad och riktad hjärtdifferentiering11. Viktiga signalmolekyler som är väsentliga för embryonal hjärtutveckling, såsom Wnt, BMP, Nodal och FGF manipuleras för att förbättra kardiomyocytdifferentiering från mänskliga iPSCs10,12. Betydande framsteg inkluderar sekventiell modulering av Wnt-signalering (aktivering följt av hämning) för robust generering av kardiomyocyter från mänskliga iPSCs13,14. Kemiskt definierade hjärtdifferentieringsrecept har undersökts för att underlätta storskalig produktion av slå kardiomyocyter15,16, som har potential att uppgraderas till industriell och klinisk nivåproduktion. Dessutom uppnås en robust expansion av tidiga iPSC-CMs för personer genom exponering för konstituerande Wnt-aktivering med hjälp av en liten kemikalie (CHIR99021)17. Senast genereras subtypspecifika kardiomyocyter genom manipulering av retinsyra (RA) och Wnt-signalvägar vid specifika differentieringsfönster under kardiomyocytens härstamning från mänskliga iPSCs18,19,20,21,22.
I detta protokoll beskriver vi ett arbetsförfarande för robust generering och spridning av mänskliga CMs som härrör från patientens perifera blod mononukleära celler. Vi presenterar protokoll för 1) omprogrammering mänskliga PBMCs till iPSCs, 2) robust generation av slå kardiomyocyter från mänskliga iPSCs, 3) snabb expansion av tidiga iPSC-CMs, 4) molekylär karakterisering av mänskliga iPSC-CMs och 5) elektrofysiologisk mätning av mänskliga iPSC-CMs på encellsnivå med patch klämma. Detta protokoll täcker de detaljerade experimentella förfarandena för att omvandla patientens blodkroppar till att slå kardiomyocyter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under iPSC omprogrammering är det viktigt att odla PBMCs i 1 vecka tills de förstoras med tydliga kärnor och cytoplasma. Eftersom PBMCs inte förökar sig är ett lämpligt cellnummer för viral transduktion viktigt för framgångsrik iPSC-omprogrammering. Cellantal PBMCs, multiplicity av infektion (MOI) och titer av virus bör övervägas och justeras för att nå optimala transduktion resultat. För hjärtdifferentiering är initial såddtäthet avgörande för att iPSCs ska nå över 90% sammanflöde den dag då CH…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av American Heart Association (AHA) Career Development Award 18CDA34110293 (M-T.Z.), Additional Ventures AVIF och SVRF awards (M-T.Z.), National Institutes of Health (NIH/NHLBI) beviljar 1R01HL124245, 1R01HL132520 och R01HL096962 (I.D.). Dr. Ming-Tao Zhao stöddes också av startfonder från Abigail Wexner Research Institute vid Nationwide Children’s Hospital.
Materials
| ABI 7300 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | ||
| Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | Microelectrode Amplifier | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer |
| BD Vacutainer CPT tube | BD Biosciences | 362753 | Blood cell separation tube |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | Sendai virus reprogramming kit |
| Digidata 1200B | Axon Instruments | Acquisition board | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | RNA extraction kit |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
| Essential 8 medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | E8 media for iPSC culture |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-glutamine alternative |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 356231 | Basement membrane matrix |
| iScript cDNA Snythesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| pCLAMP 7.0 | Molecular Devices | Electrophysiology data acquisition & analysis software | |
| Recombinant human EPO | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
| Recombinant human FLT3 | Thermo Fisher Scientific | PHC9414 | |
| Recombinant human IL3 | Peprotech | 200-03 | |
| Recombinant human IL6 | Thermo Fisher Scientific | PHC0065 | |
| Recombinant human SCF | Peprotech | 300-07 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| RPMI 1640 medium, no glucose | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | S36936 | Mounting media |
| StemPro-34 SFM | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | PBMC culture media |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444964 | qPCR master mix |
| TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | A1217703 | CM dissociation solution |
| UltraPure 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | iPSC dissociation solution |
| Y-27632 2HCl | Selleck Chemicals | S1049 |
Riferimenti
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
- Hinson, J. T., et al. Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy. Science. 349 (6251), 982-986 (2015).
- Deacon, D. C., et al. Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy. Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).
- Gifford, C. A., et al. Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier. Science. 364 (6443), 865-870 (2019).
- Lo Sardo, V., et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).
- Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
- Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now. Stem Cells. 38, 822-833 (2020).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- Zhao, M. T., et al. Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Lian, X., et al. Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation. Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).
- Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
- Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
- Liang, W., et al. Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).
- Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
- Ren, J., et al. Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes. Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).
- Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).
- Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).
- Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
- Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism. Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).
- Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. Determinants of cardiac growth and size. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).
- Campa, V. M., et al. Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).
- Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).
- Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
