JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia dello sviluppo

Hasta Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden İnsan Kardiyomiyositlerinin Üretimi ve Genişlemesi

Published: February 12, 2021
doi:
10.3791/62206
, , , , , ,
1Center for Cardiovascular Research, The Abigail Wexner Research Institute,Nationwide Children’s Hospital, 2The Heart Center,Nationwide Children’s Hospital, 3Department of Physiology and Cell Biology,The Ohio State University College of Medicine, 4Department of Anatomy,The Ohio State University College of Medicine, 5MCDB Graduate Program,The Ohio State University, 6Department of Pediatrics,The Ohio State University College of Medicine

Summary

Burada, hasta periferik kan mononükleer hücrelerinden insan kardiyomiyositlerini sağlam bir şekilde üretmek ve genişletmek için bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Tek bir kan alımından hastaya özgü kardiyomiyositler üretmek, kardiyovasküler hastalık üzerinde hassas tıbba büyük ilgi çekmiştir. İnsan indüklenen pluripotent kök hücrelerden (iPSC) kardiyak farklılaşma, embriyonik kalp gelişimi için gerekli olan tanımlanmış sinyal yolları ile modüle edilir. 2-B ve 3 boyutlu platformlarda çok sayıda kardiyak farklılaşma yöntemi çeşitli verimlilikler ve kardiyomiyosit verimi ile geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin çeşitliliği takip etmek zor olabileceği için bu, alanın dışındaki araştırmacıların kafasını karıştırdı. Burada, periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC’ ler) hastaya özgü kardiyomiyositlerin sağlam bir şekilde üretilmesini ve genişlemesini ayrıntılı olarak anlatan kapsamlı bir protokol sunuyoruz. İlk olarak, entegrasyonsuz Sendai virüs vektörleri kullanarak bir hastanın kan örneğinden yüksek verimli bir iPSC yeniden programlama protokolünü açıklıyoruz. Daha sonra, çoğu insan iPSC hattından dayak kardiyomiyositleri sağlam bir şekilde üretebilen küçük bir molekül aracılı monolayer farklılaşma yöntemini detaylandırıyoruz. Ek olarak, endüstriyel ve klinik sınıf uygulamalar için hasta kaynaklı kardiyomiyositleri hızla genişletebilen küçük bir molekül (CHIR99021) kullanılarak ölçeklenebilir bir kardiyomiyosit genişletme protokolü getirilmiştir. Sonunda, bu iPSC-CM’lerin moleküler tanımlaması ve elektrofizyolojik karakterizasyonu için ayrıntılı protokoller tasvir edilir. Bu protokolün kardiyovasküler gelişim ve kök hücre biyolojisi hakkında sınırlı bilgiye sahip yeni başlayanlar için pragmatik olmasını bekliyoruz.

Introduction

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin keşfi modern kardiyovasküler tıpta devrim yaptı1,2. İnsan iPSC’leri kardiyomiyositler, endotel hücreleri, düz kas hücreleri ve kardiyak fibroblastlar da dahil olmak üzere kalpteki tüm hücre tiplerini kendi kendine yenileyebilir ve üretebilir. Hasta iPSC türevi kardiyomiyositler (iPSC-CM’ler), genetik olarak kalıtsal kardiyovasküler hastalıkların (CVD’ ler) modellanması ve yeni ilaçlar için kardiyak güvenliğin test edilebilmesi için süresiz kaynaklar olarak hizmet edebilir3. Özellikle, hasta iPSC-CM’ler, uzun QT sendromu4 ve genişlemiş kardiyomiyopati (DCM)5gibi kardiyomiyositlerdeki kusurlardan elde edilen CVD’lerin genetik ve moleküler etiyolojilerini araştırmaya hazırdır. CRISPR/Cas9 aracılı genom düzenleme ile birlikte, hasta iPSC-CM’ler, doğumsal kalp kusurları (CHD’ler)6,7,8dahil olmak üzere CVD’lerin karmaşık genetik temelini anlamak için benzeri görülmemiş bir yol açmıştır. İnsan iPSC-CM’leri ayrıca kalp krizi sırasında hasarlı miyokard doldurmak için otolog hücre kaynakları olarak hizmet etme potansiyelleri sergilemektedir9. Son yıllarda, kardiyak rejenerasyon ve ilaç testi için tanımlanmış alt tiplere (atriyal, ventriküler ve nodal) sahip yüksek kaliteli insan iPSC-CM’leri üretmek çok önemli hale gelmiştir10.

Kardiyak farklılaşma insan iPSC’lerinden son on yılda büyük ölçüde gelişmiştir. Farklılaşma yöntemleri embriyoid cisim (EB) bazlı spontan farklılaşmadan kimyasal olarak tanımlanmış ve yönlendirilmiş kardiyak farklılaşmaya geçmiştir11. Wnt, BMP, Nodal ve FGF gibi embriyonik kalp gelişimi için gerekli olan anahtar sinyal molekülleri, insan iPSC’lerinden kardiyomiyosit farklılığını arttırmak için manipüle edilir10,12. Önemli gelişmeler, insan iPSC’lerinden sağlam kardiyomiyosit üretimi için Wnt sinyalinin sıralı modülasyonunu (aktivasyonu ve ardından inhibisyon)içerir 13,14. Endüstriyel ve klinik düzeyde üretime yükseltilme potansiyeline sahipolan 15 , 16dayak kardiyomiyositlerinin büyük ölçekli üretimini kolaylaştırmak için kimyasal olarak tanımlanmış kardiyak farklılaşma tarifleri araştırılmıştır. Ayrıca, erken insan iPSC-CM’lerinin sağlam genişlemesi, küçük bir kimyasal (CHIR99021)17kullanılarak constitutive Wnt aktivasyonuna maruz kalarak elde edilir. Son zamanlarda, alt tipe özgü kardiyomiyositler, insan iPSC’lerinden kardiyomiyosit soy taahhüdü sırasında belirli farklılaşma pencerelerinde retinoik asit (RA) ve Wnt sinyal yollarının manipülasyonu yoluyla üretilir18,19,20,21,22.

Bu protokolde, hasta periferik kan mononükleer hücrelerinden kaynaklanan insan CD’lerinin sağlam üretimi ve çoğalması için bir çalışma prosedürünü detaylandırıyoruz. 1) insan PBMC’lerinin iPSC’lere yeniden programlanması, 2) insan iPSC’lerinden sağlam dayak kardiyomiyositleri üretimi, 3) erken iPSC-CM’lerin hızlı genişlemesi, 4) insan iPSC-CM’lerin moleküler karakterizasyonu ve 5) insan iPSC-CM’lerin yama kelepçesi ile tek hücreli düzeyde elektrofizyolojik ölçümü için protokoller sunuyoruz. Bu protokol, hasta kan hücrelerinin dayak kardiyomiyositlerine dönüştürülmesiyle ilgili ayrıntılı deneysel prosedürleri kapsamaktadır.

Protocol

İnsan denekler için deneysel protokoller ve bilgilendirilmiş onay, Nationwide Çocuk Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylandı. 1. Hücre kültürü ortamlarının, çözümlerinin ve reaktiflerinin hazırlanması PBMC medyayı hazırlama 20 mL bazal PBMC kültür medya (1x) ve 0,52 mL takviye karıştırın. Her birine 20 μL SCF ve FLT3 (stok konsantrasyonu: 100 μg/mL), her biri 4 μL IL3, IL6 ve EPO (stok konsantrasyonu: 100 μg/mL) ve 200 μL L-…

Representative Results

PBMC’lerden insan iPSC yeniden programlanması7 gün boyunca Complete Blood Media ile ön kültürden sonra, PBMC’ler görünür çekirdek ve sitoplazma ile büyük hale gelir (Şekil 1B), virüs transfeksiyona hazır olduklarını gösterir. Sendai virüsünün yeniden programlanması faktörleri ile transfeksiyondan sonra, PBMC’ler bir hafta daha epigenetik yeniden programlama işleminden geçecektir. Tipik olarak, 1 x 10 5 PBMC’nin tra…

Discussion

iPSC yeniden programlanması sırasında, PBMC’leri net çekirdek ve sitoplazma ile genişleyene kadar 1 hafta boyunca kültürlendirmek önemlidir. PBMC’ler çoğalmadığından, viral transdüksiyon için uygun bir hücre numarası başarılı iPSC yeniden programlanması için önemlidir. PBMC’lerin hücre sayısı, enfeksiyonun çokluğu (MOI) ve virüs titresi göz önünde bulundurulmalı ve en uygun transdüksiyon sonuçlarına ulaşacak şekilde ayarlanmalıdır. Kardiyak farklılaşma için, ilk tohumlama yoğun…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Amerikan Kalp Derneği (AHA) Kariyer Geliştirme Ödülü 18CDA34110293 (M-T.Z.), Ek Girişimler AVIF ve SVRF ödülleri (M-T.Z.), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH/NHLBI) tarafından desteklendi. 1R01HL132520 ve R01HL096962 (I.D.). Dr. Ming-Tao Zhao, Nationwide Çocuk Hastanesi Abigail Wexner Araştırma Enstitüsü’nden başlangıç fonlarıyla da desteklendi.

Materials

ABI 7300 Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific
Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier Molecular Devices Microelectrode Amplifier
B27 supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
B27 supplement minus insulin Thermo Fisher Scientific A1895601
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer
BD Vacutainer CPT tube BD Biosciences 362753 Blood cell separation tube
CHIR99021 Selleck Chemicals S2924
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517 Sendai virus reprogramming kit
Digidata 1200B Axon Instruments Acquisition board
Direct-zol RNA Miniprep kit Zymo Research R2050 RNA extraction kit
DMEM/F12 Thermo Fisher Scientific 11330057
Essential 8 medium Thermo Fisher Scientific A1517001 E8 media for iPSC culture
GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 L-glutamine alternative
Growth factor reduced Matrigel Corning 356231 Basement membrane matrix
iScript cDNA Snythesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IWR-1-endo Selleck Chemicals S7086
KnockOut Serum Replacement (KSR) Thermo Fisher Scientific 10828028
pCLAMP 7.0 Molecular Devices Electrophysiology data acquisition & analysis software
Recombinant human EPO Thermo Fisher Scientific PHC9631
Recombinant human FLT3 Thermo Fisher Scientific PHC9414
Recombinant human IL3 Peprotech 200-03
Recombinant human IL6 Thermo Fisher Scientific PHC0065
Recombinant human SCF Peprotech 300-07
RPMI 1640 medium Thermo Fisher Scientific 11875093
RPMI 1640 medium, no glucose Thermo Fisher Scientific 11879020
SlowFade Gold Antifade Mountant Thermo Fisher Scientific S36936 Mounting media
StemPro-34 SFM Thermo Fisher Scientific 10639011 PBMC culture media
TaqMan Fast Advanced Master Mix Thermo Fisher Scientific 4444964 qPCR master mix
TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red Thermo Fisher Scientific A1217703 CM dissociation solution
UltraPure 0.5 M EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 iPSC dissociation solution
Y-27632 2HCl Selleck Chemicals S1049
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  2. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  4. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  5. Hinson, J. T., et al. Titin mutations in iPS cells define sarcomere insufficiency as a cause of dilated cardiomyopathy. Science. 349 (6251), 982-986 (2015).
  6. Deacon, D. C., et al. Combinatorial interactions of genetic variants in human cardiomyopathy. Nature Biomedical Engineering. 3 (2), 147-157 (2019).
  7. Gifford, C. A., et al. Oligogenic inheritance of a human heart disease involving a genetic modifier. Science. 364 (6443), 865-870 (2019).
  8. Lo Sardo, V., et al. Unveiling the role of the most impactful cardiovascular risk locus through haplotype editing. Cell. 175 (7), 1796-1810 (2018).
  9. Liu, Y. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes restore function in infarcted hearts of non-human primates. Nature Biotechnology. 36 (7), 597-605 (2018).
  10. Zhao, M. T., Shao, N. Y., Garg, V. Subtype-specific cardiomyocytes for precision medicine: where are we now. Stem Cells. 38, 822-833 (2020).
  11. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  12. Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: from developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
  13. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  14. Zhao, M. T., et al. Molecular and functional resemblance of differentiated cells derived from isogenic human iPSCs and SCNT-derived ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (52), 11111-11120 (2017).
  15. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  16. Lian, X., et al. Chemically defined, albumin-free human cardiomyocyte generation. Nature Methods. 12 (7), 595-596 (2015).
  17. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human ipsc-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  18. Lee, J. H., Protze, S. I., Laksman, Z., Backx, P. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes develop from distinct mesoderm populations. Cell Stem Cell. 21 (2), 179-194 (2017).
  19. Liang, W., et al. Canonical Wnt signaling promotes pacemaker cell specification of cardiac mesodermal cells derived from mouse and human embryonic stem cells. Stem Cells. 38 (3), 352-368 (2020).
  20. Protze, S. I., et al. Sinoatrial node cardiomyocytes derived from human pluripotent cells function as a biological pacemaker. Nature Biotechnology. 35 (1), 56-68 (2017).
  21. Ren, J., et al. Canonical Wnt5b signaling directs outlying Nkx2.5+ mesoderm into pacemaker cardiomyocytes. Developmental Cell. 50 (6), 729-743 (2019).
  22. Zhang, Q., et al. Direct differentiation of atrial and ventricular myocytes from human embryonic stem cells by alternating retinoid signals. Cell Research. 21 (4), 579-587 (2011).
  23. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Seriers B, Physical and Biological Sciences. 85 (8), 348-362 (2009).
  24. Stacey, G. N., Crook, J. M., Hei, D., Ludwig, T. Banking human induced pluripotent stem cells: lessons learned from embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (4), 385-388 (2013).
  25. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  26. Zhao, L., Ben-Yair, R., Burns, C. E., Burns, C. G. Endocardial notch signaling promotes cardiomyocyte proliferation in the regenerating zebrafish heart through Wnt pathway antagonism. Cell Reports. 26 (3), 546-554 (2019).
  27. Heallen, T. R., Kadow, Z. A., Wang, J., Martin, J. F. Determinants of cardiac growth and size. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 12 (3), 037150 (2020).
  28. Campa, V. M., et al. Notch activates cell cycle reentry and progression in quiescent cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 129-141 (2008).
  29. Collesi, C., Zentilin, L., Sinagra, G., Giacca, M. Notch1 signaling stimulates proliferation of immature cardiomyocytes. Journal of Cell Biology. 183 (1), 117-128 (2008).
  30. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).

Tags

Keywords: Cardiomyocyte GenerationPeripheral Blood Mononuclear CellsIPSC ReprogrammingCardiovascular Disease ModelingCardiac Toxicity TestingDifferentiation ProtocolCell CultureSendai VirusPBMCE8 MediumCardiomyocyte Differentiation Media
check_url/it/62206?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Ye, S., Wan, X., Su, J., Patel, A., Justis, B., Deschênes, I., Zhao, M. Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells. J. Vis. Exp. (168), e62206, doi:10.3791/62206 (2021).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image