عزل وثقافة البلاعم القلبية المقيمة من العقدة الجيبية الأذينية والأذينية البطينية
Summary
يوفر البروتوكول المقدم هنا نهجا خطوة بخطوة لعزل الضامة القلبية المقيمة من العقدة الجيبية الأذينية (SAN) ومنطقة العقدة الأذينية البطينية (AVN) لقلوب الفئران.
Abstract
وقد ثبت أن البلاعم القلبية المقيمة تسهل التوصيل الكهربائي في القلب. يبدأ إيقاع القلب الفسيولوجي بنبضات كهربائية متولدة في العقدة الجيبية الأذينية (SAN) ثم يتم إجراؤها على البطينين عبر العقدة الأذينية البطينية (AVN). لمزيد من الدراسة لدور البلاعم المقيمة في نظام التوصيل القلبي ، من الضروري عزل البلاعم المقيمة بشكل صحيح عن SAN و AVN ، لكنه لا يزال يمثل تحديا. هنا ، نقدم بروتوكولا للتشريح المجهري الموثوق به ل SAN و AVN في قلوب الفئران متبوعا بعزل وثقافة الضامة المقيمة.
يتم تحديد وتشريح كل من SAN الذي يقع عند تقاطع محطة crista مع الوريد الأجوف العلوي ، و AVN الذي يقع في قمة مثلث Koch ، وتشريحه بشكل دقيق. يتم تأكيد الموقع الصحيح من خلال التحليل النسيجي للأنسجة التي أجريت مع صبغة ماسون ثلاثية الألوان ومضاد HCN4.
ثم يتم هضم الأنسجة المجهرية إنزيميا للحصول على معلقات خلية واحدة تليها الحضانة مع لوحة محددة من الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات سطح محددة من نوع الخلية. يسمح ذلك بتحديد أو عد أو عزل مجموعات الخلايا المختلفة عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت. للتمييز بين الضامة القلبية المقيمة والخلايا المناعية الأخرى في عضلة القلب ، وخاصة الضامة المشتقة من الخلايا الوحيدة ، هناك حاجة إلى استراتيجية بوابة دقيقة. أولا ، يتم الكشف عن خلايا السلالة اللمفاوية واستبعادها من مزيد من التحليل. بعد ذلك ، يتم تحديد الخلايا النخاعية مع تحديد البلاعم المقيمة من خلال التعبير العالي لكل من CD45 و CD11b ، والتعبير المنخفض عن Ly6C. مع فرز الخلايا ، يمكن بعد ذلك زراعة البلاعم القلبية المعزولة في المختبر على مدار عدة أيام لمزيد من التحقيق. لذلك ، نصف بروتوكولا لعزل البلاعم القلبية الموجودة داخل نظام التوصيل القلبي. نناقش المزالق في التشريح الدقيق وهضم SAN و AVN ، ونقدم استراتيجية بوابات لتحديد الضامة القلبية وعدها وفرزها بشكل موثوق عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة.
Introduction
تبدأ العقدة الجيبية الأذينية (SAN) من الناحية الفسيولوجية النبضة الكهربائية ، وبالتالي فهي جهاز تنظيم ضربات القلب الأساسي. تقوم العقدة الأذينية البطينية (AVN) بتوصيل النبضة الكهربائية من الأذينين إلى البطينين وتعمل أيضا كجهاز تنظيم ضربات القلب الفرعي1. بشكل عام ، يعد توليد وتوصيل النبضات الكهربائية عملية معقدة يمكن تعديلها بواسطة عوامل مختلفة2 ، بما في ذلك البلاعم المقيمة في مناطق SAN / AVN. توضح دراسة حديثة أجراها Hulsmans et al. مجموعة محددة من الضامة القلبية المقيمة التي يتم تخصيبها في AVN وتعمل كلاعبين رئيسيين في الحفاظ على ضربات قلب ثابتة3. ووجدوا أن البلاعم مقترنة كهربائيا بخلايا عضلة القلب ويمكن أن تغير الخصائص الكهربائية لخلايا عضلة القلب المقترنة. لاحظ المؤلفون أيضا أن مثل هذه الخلايا الموصلة التي تتداخل مع الضامة موجودة أيضا في مكونات أخرى من نظام التوصيل القلبي ، مثل SAN.
حاليا ، من غير المعروف تماما ما إذا كان النمط الظاهري للبلاعم القلبية المقيمة يختلف بين مناطق القلب. ومع ذلك ، فقد ثبت أن البيئة المكروية للأنسجة يمكن أن تؤثر على النسخ والتجديد التكاثري للبلاعم الأنسجية4. علاوة على ذلك ، نظرا لأنه ثبت أن النمط الظاهري للخلية العضلية القلبية مختلف بين المناطق ، فقد تكون التأثيرات الوظيفية للبلاعم على خلايا عضلة القلب خاصة بالمنطقة ، حتى لو كان النمط الظاهري للبلاعم نفسه هو نفسه. لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات على مناطق قلبية محددة.
أظهرت الدراسات الحديثة أنه في حالة مستقرة ، يتم إنشاء البلاعم المقيمة في الأنسجة قبل الولادة ، وتنشأ بشكل مستقل عن تكون الدم النهائي ، وتستمر حتى مرحلة البلوغ5. ومع ذلك ، بعد استنفاد البلاعم أو أثناء التهاب القلب ، تساهم حيدات Ly6chi في تجديد عدد البلاعم القلبية6. أظهرت الدراسات التي تضمنت تتبع النسب الجيني ، و parabiosis ، ورسم خرائط المصير ، وتتبع الخلايا تعايش مجموعة متنوعة من مجموعات البلاعم المقيمة في الأنسجة في الأعضاء والأنسجة ، وكذلك السلوك الخلوي المختلف للمجموعات الفرعية من البلاعم التي يحتمل أن تكون مرتبطة بتطورها7،8،9.
استفاد توصيف البلاعم القلبية المقيمة من استخدام فرز الخلايا المنشطة المغناطيسية (MACS) وفرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت. هذه الطرق مفيدة بشكل خاص لعزل مجموعات خلايا معينة من كسور الأنسجة المتعددة عن طريق تسميتها بعلامات سطح الخلية. هذا لا يؤدي فقط إلى نقاء أعلى لنوع الخلايا المناعية المعزولة ، ولكنه يسمح أيضا بتحليل النمط الظاهري. هنا ، نقدم بروتوكولا يتضمن خلايا مغلفة بالخرز المغناطيسي متبوعا بفرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت لإثراء الضامة القلبية المقيمة المعزولة على وجه التحديد من منطقة SAN و AVN.
لاستكشاف خصائص البلاعم القلبية المقيمة في نظام التوصيل ووظيفتها في التوصيل القلبي وعدم انتظام ضربات القلب ، يعد التوطين الدقيق وتشريح SAN و AVN أمرا بالغ الأهمية. للتشريح المجهري ل SAN و AVN ، يتم استخدام المعالم التشريحية لتحديد المنطقة10. باختصار ، يقع SAN عند تقاطع الوريد الأجوف العلوي والأذين الأيمن. يقع AVN داخل مثلث كوخ ، الذي يحده من الأمام نشرة الحاجز للصمام ثلاثي الشرف ، وخلفيا وتر تودارو11. كما نقدم إجراء تشريح دقيق ل SAN و AVN في الفئران وهو ما تؤكده الأنسجة وتلطيخ التألق المناعي.
يمكن استخدام البلاعم المقيمة المعزولة لإجراء مزيد من التجارب مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أو يمكن استعادتها وزراعتها لأكثر من أسبوعين مما يسمح بإجراء تجارب مختلفة في المختبر. لذلك ، يصف بروتوكولنا إجراء قيما للغاية لأخصائي الإيقاع المناعي. يوضح الجدول 1 تكوين جميع الحلول اللازمة ، ويبين الشكل 1 معالم التشريح المجهري ل SAN و AVN. الشكل 2 هو توضيح تخطيطي لتوطين SAN و AVN. يوضح الشكل 3 التلوين النسيجي ل SAN و AVN (تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان والتألق المناعي). يوضح الشكل 4 استراتيجية بوابة خطوة بخطوة لعزل البلاعم القلبية المقيمة عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المخطوطة ، نصف بروتوكولا لإثراء الضامة القلبية المقيمة على وجه التحديد من مناطق SAN و AVN بنقاوة عالية.
تنقسم البلاعم إلى مجموعات فرعية بناء على موقعها التشريحي والنمط الظاهري الوظيفي. يمكنهم أيضا التبديل من نمط ظاهري وظيفي إلى آخر استجابة لإشارات البيئة الدقيقة المتغ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل مجلس المنح الدراسية الصيني (CSC ، إلى R. Xia) ، والمركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية (DZHK ؛ 81X2600255 إلى S. Clauss ، و 81Z0600206 إلى S. Kääb ، و 81Z0600204 إلى CS) ، ومؤسسة Corona Foundation (S199 / 10079/2019 إلى S. Clauss) ، و SFB 914 (المشروع Z01 إلى S. Massberg) ، و ERA-NET حول أمراض القلب والأوعية الدموية (ERA-CVD ؛ 01KL1910 إلى S. Clauss) و Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (إلى S. Clauss). لم يكن للممولين أي دور في إعداد المخطوطات.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Pipette,volume 10ul, 100ul, 1000ul | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | vwr | 10836-004 | |
| Leica microscope | Leica microsystems | Leica DM6 | |
| Flow cytometry machine | |||
| Beckman Coulter | Beckman coulter | MoFlo Astrios | |
| Software | |||
| FlowJo v10 | FlowJo | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | FALCON | 352070 | |
| Cover slips | Thermo scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Component of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| Collagenase I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
| HEPES buffer | Sigma | H4034 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | F2442-500ml | |
| Penicillin − Streptomycin | Sigma | P4083 | |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 ml | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 ml/ml | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Anti-mouse Ly6C FITC (clone HK1.4) | BioLegend | Cat# 128006 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse F4/80 PE/Cy7(clone BM8) | BioLegend | Cat# 123114 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD64 APC (clone X54-5/7.1) | BioLegend | Cat# 139306 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD11b APC/Cy7(clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101226 | diluted to 1:100 |
| Anti-mouse CD45 PE (clone 30-F11) | BioLegend | Cat# 103106 | diluted to 1:100 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Charles River Laboratories | ||
Riferimenti
- Nikolaidou, T., Aslanidi, O. V., Zhang, H., Efimov, I. R. Structure-function relationship in the sinus and atrioventricular nodes. Pediatric Cardiology. 33 (6), 890-899 (2012).
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Review Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Gordon, S., Pluddemann, A. Tissue macrophages: heterogeneity and functions. BMC Biology. 15 (1), 53 (2017).
- Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nature Immunology. 14 (10), 986-995 (2013).
- Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Ye Sheng, X., et al. Isolation and characterization of atrioventricular nodal cells from neonate rabbit heart. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 4 (6), 936-946 (2011).
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).
- Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
- Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circulation Research. 124 (2), 263-278 (2019).
- Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
- Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
