Alternatif Viskoz-Atalet Kuvveti Jetting ile In Vitro Hydrogel Mikrokaçörlerinin 3D Baskısı
Summary
Burada sunulan, hidrojel mikrokaçörlerin yapımını sağlamak için viskoz-atalet kuvvetlerinin alternatifi tarafından tahrik edilen hafif bir 3D baskı tekniğidir. Ev yapımı nozüller esneklik sunarak farklı malzemeler ve çaplar için kolay değişim sağlar. 50-500 μm çapında hücre bağlama mikrokaderleri elde edilebilir ve daha fazla kültleme için toplanabilir.
Abstract
Mikrokaçarlar, 60-250 μm çapında boncuklar ve büyük ölçekli hücre kültürleri için taşıyıcı olarak yaygın olarak kullanılan geniş bir özel yüzey alanıdır. Mikrokaçör kültürü teknolojisi sitolojik araştırmalarda ana tekniklerden biri haline gelmiştir ve yaygın olarak büyük ölçekli hücre genişlemesi alanında kullanılmaktadır. Mikrokaçörlerin in vitro doku mühendisliği yapımı ve klinik ilaç taramasında giderek daha önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Mikrokaçörleri hazırlamak için mevcut yöntemler arasında genellikle karmaşık akış kanalı tasarımına, uyumsuz iki fazlı arayüze ve sabit bir nozul şekline dayanan mikroakışkan çipler ve mürekkep püskürtmeli baskı bulunur. Bu yöntemler, birden fazla biyoink’e uygulandığında karmaşık nozül işleme, sakıncalı nozül değişiklikleri ve aşırı ekstrüzyon kuvvetlerinin zorluklarıyla karşı karşıyadır. Bu çalışmada, 100-300 μm çapında hidrojel mikrokaçörlerin yapımını sağlamak için alternatif viskoz-atalet kuvveti jetleme adı verilen bir 3D baskı tekniği uygulanmıştır. Hücreler daha sonra doku mühendisliği modülleri oluşturmak için mikrokaçörler üzerine tohumlandı. Mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntem çok çeşitli biyoaktif malzemeler için ücretsiz nozül ucu çapı, esnek nozül anahtarlama, baskı parametrelerinin serbest kontrolü ve hafif baskı koşulları sunar.
Introduction
Mikrokaçarlar 60-250 μm çapında ve geniş bir yüzey alanına sahip boncuklardır ve genellikle büyük ölçekli hücre kültürü için kullanılır1,2. Dış yüzeyleri hücreler için bol miktarda büyüme alanı sağlar ve iç mekansal çoğalma için bir destek yapısı sağlar. Küresel yapı ayrıca pH, O2 ve besin ve metabolit konsantrasyonu da dahil olmak üzere parametreleri izleme ve kontrol etmede kolaylık sağlar. Karıştırılmış tank biyoreaktörleri ile birlikte kullanıldığında, mikrokaçörler geleneksel kültürlere kıyasla nispeten küçük bir hacimde daha yüksek hücre yoğunlukları elde edebilir, böylece büyük ölçekli kültürlere ulaşmak için uygun maliyetli bir yol sağlayabilir3. Mikrokaç kültürü teknolojisi sitolojik araştırmalarda ana tekniklerden biri haline gelmiştir ve kök hücrelerin, hepatositlerin, kondrositlerin, fibroblastların ve diğer yapıların büyük ölçekli genişlemesi alanında çok ilerleme kaydedildi4. Ayrıca ideal ilaç dağıtım araçları ve aşağıdan yukarıya üniteler oldukları ve bu nedenle klinik ilaç taraması ve in vitro doku mühendisliği onarımında giderek daha önemli bir rol üstlendikleri bulunmuştur5.
Farklı senaryolarda mekanik özellik gereksinimlerini karşılamak için, mikrokaçörlerin yapımında kullanılmak üzere birden fazla hidrojel malzeme türü geliştirilmiştir6,7,8,9,10,11. Aljinat ve hyaluronik asit (HA) hidrojelleri, iyi biyouyumlulukları ve çapraz bağlantıları nedeniyle en çok kullanılan mikrokaç malzemelerden ikisidir12,13. Aljinat kalsiyum klorür ile kolayca çapraz bağlanabilir ve mekanik özellikleri çapraz bağlama süresi değiştirilerek modüle edilebilir. Tyramine konjuge HA, hidrojen peroksit ve yaban turpu peroksidaz14 ile katalize edilen tyramine moieties’in oksidatif bağlantısı ile çapraz bağlanır. Kollajen, benzersiz spiral yapısı ve çapraz bağlı fiber ağı nedeniyle, hücre bağlanmasını daha da teşvik etmek için mikrokaçörlere karışmak için genellikle bir yardımcı olarak kullanılır15,16.
Mikrokaçör hazırlamanın güncel yöntemleri arasında mikroakışkan çipler, mürekkep püskürtmeli baskı ve elektrospray17,18,19,20,21,22,23 bulunur. Mikroakışkan çiplerin tek tip boyutlu mikrokaçörler üretmede hızlı ve verimli olduğu kanıtlanmıştır24. Ancak, bu teknoloji karmaşık bir akış kanalı tasarımına ve üretim sürecine dayanır25. Mürekkep püskürtmeli baskı sırasında yüksek sıcaklık veya aşırı ekstrüzyon kuvvetlerinin yanı sıra elektrospray yaklaşımındaki yoğun elektrik alanları, malzemenin özelliklerini, özellikle biyolojik aktivitesini olumsuz yönde etkileyebilir19. Ayrıca, çeşitli biyomalzemelere ve çaplara uygulandığında, bu yöntemlerde kullanılan özelleştirilmiş nozüller sınırlı işlem karmaşıklığı, yüksek maliyet ve düşük esneklik sağlar.
Mikrokaç hazırlama için uygun bir yöntem sağlamak için, hidrojel mikrokaçörleri oluşturmak için alternatif viskoz-atalet kuvvetleri püskürtme (AVIFJ) adı verilen bir 3D baskı tekniği uygulanmıştır. Teknik, nozül ucunun yüzey gerilimini aşmak ve böylece damlacıklar oluşturmak için dikey titreşim sırasında oluşturulan aşağı doğru itici kuvvetler ve statik basınç kullanır. Şiddetli kuvvetler ve termal koşullar yerine, küçük hızlı yer değiştirmeler baskı sırasında doğrudan nozul üzerinde hareket eder, biyoink’in fizikokimyasal özellikleri üzerinde küçük bir etkiye neden olan ve biyoaktif malzemeler için büyük bir cazibe sunan. AVIFJ yöntemi kullanılarak, 100-300 μm çapında birden fazla biyomalzemenin mikrokaçları başarıyla oluşturulmuştur. Ayrıca, mikrokaçların hücreleri iyi bağladığı ve yapışan hücreler için uygun bir büyüme ortamı sağladığı daha da kanıtlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol, çok tip hidrojel mikrokaçörlerin hazırlanması ve daha sonra hücre tohumlama için talimatlar sağlar. Mikroakışkan çip ve mürekkep püskürtmeli baskı yöntemleriyle karşılaştırıldığında, AVIFJ mikrokaçörler oluşturmaya yönelik yaklaşımı daha fazla esneklik ve biyouyumluluk sunar. Bağımsız bir nozül, bu baskı sistemlerinde cam mikropipletler de dahil olmak üzere çok çeşitli hafif nozüllerin kullanılmasını sağlar. Son derece kontrol edilebilir işleme, r…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (3212007), Tsinghua Üniversitesi Girişim Bilimsel Araştırma Programı (20197050024), Tsinghua Üniversitesi Bahar Esintisi Fonu (20201080760), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (51805294), Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2018YFA0703004) ve 111 Projesi (B17026) tarafından desteklendi.
Materials
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Human non-small cell lung cancer cell line |
| Bright field microscope | Olympus | DP70 | |
| Confocal microscope | Nikon | TI-FL | |
| Fetal bovine serum, FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Glass micropipettes | sutter instrument | b150-110-10 | |
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| H-DMEM | GIBCO | 11960-044 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Horseradish peroxidase powder | SIGMA | P6782 | |
| Hydrophobic agent | 3M | PN7026 | Follow the manufacturer's instructions and use after dilution |
| Micro-forge device | narishige | MF-900 | |
| Non-essential amino acids, NEAA | GIBCO | 11140-050 | non-essential amino acids |
| Penicillin G and streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Petri dish | SIGMA | P5731-500EA | |
| Puller | sutter instrument | P-1000 | |
| Sodium alginate | SIGMA | A0682 | |
| Trypsin | GIBCO | 25200-056 | |
| Type I collagen solution from rat tail | SIGMA | C3867 |
Riferimenti
- Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic Translation. 3, 51-57 (2015).
- Badenes, S. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A. V., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems. Journal of Biotechnol. 234, 71-82 (2016).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Da Silva, C. L., Cabral, J. M. S. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
- Naqvi, S. M., et al. Living cell factories – electrosprayed microcapsules and microcarriers for minimally invasive delivery. Advanced Materials. 28, 5662-5671 (2016).
- Sarkar, S., et al. Chitosan: A promising therapeutic agent and effective drug delivery system in managing diabetes mellitus. Carbohydrate Polymers. 247, (2020).
- Sulaiman, S. B., Idrus, R. B. H., Hwei, N. M. Gelatin microsphere for cartilage tissue engineering: current and future strategies. Polymers. 12, (2020).
- Huang, L., Abdalla, A. M. E., Xiao, L., Yang, G. Biopolymer-based microcarriers for three-dimensional cell culture and engineered tissue formation. International Journal of Molecular Sciences. 21, (2020).
- Isiklan, N., Tokmak, S. Development of thermo/pH-responsive chitosan coated pectin-graft-poly(N, N-diethyl acrylamide) microcarriers. Carbohydrate Polymers. 218, 112-125 (2019).
- Lau, T. T., Wang, C., Wang, D. A. Cell delivery with genipin crosslinked gelatin microspheres in hydrogel/microcarrier composite. Composites Science & Technology. 70, 1909-1914 (2010).
- Lau, T. T. Hydrogel-microcarrier composite systems for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10, 1646-1662 (2014).
- Kwon, Y. J., Peng, C. A. Calcium-alginate gel bead cross-linked with gelatin as microcarrier for anchorage-dependent cell culture. Biotechniques. 33, 218 (2002).
- Leach, J. B., Bivens, K. A., Patrick, C. W., Schmidt, C. E. Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds. Biotechnology & Bioengineering. 82, 578-589 (2003).
- Kurisawa, M., Chung, J. E., Yang, Y. Y., Gao, S. J., Uyama, H. Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering. Chemical Communications. 34, 4312-4314 (2005).
- Yao, R., Alkhawtani, A. Y. F., Chen, R., Luan, J., Xu, M. Rapid and efficient in vivo angiogenesis directed by electro-assisted bioprinting of alginate/collagen microspheres with human umbilical vein endothelial cell coating layer. International Journal of Bioprinting. 5, 194 (2019).
- Mahou, R., Vlahos, A. E., Shulman, A., Sefton, M. V. Interpenetrating alginate-collagen polymer network microspheres for modular tissue engineering. Acs Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3704-3712 (2017).
- Aftab, A., et al. Microfluidic platform for encapsulation of plant extract in chitosan microcarriers embedding silver nanoparticles for breast cancer cells. Applied Nanoscience. 10, 2281-2293 (2020).
- Park, W., et al. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Chui, C., et al. Electrosprayed genipin cross-linked alginate-chitosan microcarriers for ex vivo expansion of mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 122-133 (2019).
- Min, N. G., Ku, M., Yang, J., Kim, S. Microfluidic production of uniform microcarriers with multicompartments through phase separation in emulsion drops. Chemistry of Materials. 28 (5), 1430-1438 (2016).
- Park, W., Jang, S., Kim, T. W., Bae, J., Lee, E. A. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Xu, T., Kincaid, H., Atala, A., Yoo, J. J. High-Throughput Production of Single-Cell Microparticles Using an Inkjet Printing Technology. Journal of Manufacturing Science & Engineering. 130, 137-139 (2008).
- Rao, W., et al. Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules. Biomaterials. 27 (27), 7762-7773 (2014).
- Choi, C. H., Weitz, D. A., Lee, C. S. One step formation of controllable complex emulsions: From functional particles to simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic agents into desired position. Advanced Materials. 25, 2536-2541 (2013).
- Choi, A., Seo, K. D., Kim, D. W., Kim, B. C., Dong, S. K. Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications. Lab On A Chip. 17 (4), 591-613 (2017).
- Liu, T., Pang, Y., Zhou, Z., Yao, R., Sun, W. An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models. Acta Biomaterialia. 95, 245-257 (2019).
- Hassan, K., et al. Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications. NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).
- Vithani, K., et al. An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems. Pharmaceutical Research. 36, (2019).
