الطباعة 3D من الناقلات الدقيقة هيدروجيل في المختبر عن طريق تناوب القوة اللزجة بالقصور الذاتي النفث
Summary
يظهر هنا تقنية طباعة 3D خفيفة مدفوعة بقوى لزجة بالقصور الذاتي بالتناوب لتمكين بناء ناقلات هيدروجيل دقيقة. توفر الفوهات محلية الصنع المرونة ، مما يسمح بسهولة الاستبدال للمواد والأقطار المختلفة. يمكن الحصول على الناقلات الدقيقة المرتبطة بالخلايا التي يبلغ قطرها 50-500 ميكرومتر وجمعها لمزيد من الثقافة.
Abstract
الناقلات الدقيقة هي حبات يبلغ قطرها 60-250 ميكرومتر ومساحة سطح محددة كبيرة ، والتي تستخدم عادة كحاملات لمزارع الخلايا واسعة النطاق. أصبحت تكنولوجيا زراعة الناقلات الدقيقة واحدة من التقنيات الرئيسية في البحوث الخلوية وتستخدم عادة في مجال توسيع الخلايا على نطاق واسع. كما ثبت أن الناقلات الدقيقة تلعب دورا متزايد الأهمية في بناء هندسة الأنسجة في المختبر وفحص الأدوية السريرية. تشمل الطرق الحالية لإعداد الناقلات الدقيقة رقائق الموائع الدقيقة والطباعة النافثة للحبر ، والتي غالبا ما تعتمد على تصميم قناة تدفق معقدة ، وواجهة غير متوافقة من مرحلتين ، وشكل فوهة ثابتة. تواجه هذه الطرق تحديات معالجة الفوهة المعقدة ، وتغييرات الفوهة غير المريحة ، وقوى البثق المفرطة عند تطبيقها على حبر حيوي متعدد. في هذه الدراسة ، تم تطبيق تقنية الطباعة ثلاثية الأبعاد ، والتي تسمى نفث القوة اللزجة بالقصور الذاتي بالتناوب ، لتمكين بناء ناقلات هيدروجيل صغيرة يبلغ قطرها 100-300 ميكرومتر. تم زرع الخلايا في وقت لاحق على الناقلات الدقيقة لتشكيل وحدات هندسة الأنسجة. بالمقارنة مع الطرق الحالية ، توفر هذه الطريقة قطر طرف فوهة مجاني ، وتبديل فوهة مرن ، وتحكم مجاني في معلمات الطباعة ، وظروف طباعة معتدلة لمجموعة واسعة من المواد النشطة بيولوجيا.
Introduction
الناقلات الدقيقة هي خرز يبلغ قطره 60-250 ميكرومتر ومساحة سطح محددة كبيرة وتستخدم عادة لزراعة الخلايا على نطاق واسع1,2. يوفر سطحها الخارجي مواقع نمو وفيرة للخلايا ، ويوفر الجزء الداخلي بنية دعم للانتشار المكاني. يوفر الهيكل الكروي أيضا الراحة في مراقبة المعلمات والتحكم فيها ، بما في ذلك الرقم الهيدروجيني و O2 وتركيز العناصر الغذائية والأيضات. وعند استخدامها مع المفاعلات الحيوية للخزانات المقلوبة، يمكن للناقلات الدقيقة أن تحقق كثافات خلوية أعلى في حجم صغير نسبيا مقارنة بالثقافات التقليدية، مما يوفر طريقة فعالة من حيث التكلفة لتحقيق ثقافات واسعة النطاق3. أصبحت تكنولوجيا زراعة الناقلات الدقيقة واحدة من التقنيات الرئيسية في البحوث الخلوية، وتم إحراز تقدم كبير في مجال التوسع على نطاق واسع في الخلايا الجذعية، وخلايا الكبد، والخلايا الغضروفية والخلايا الليفية وغيرها من الهياكل4. كما وجد أنها مركبات مثالية لتوصيل الأدوية ووحدات من أسفل إلى أعلى، وبالتالي تلعب دورا متزايد الأهمية في فحص الأدوية السريرية وإصلاح هندسة الأنسجة في المختبر5.
لتلبية متطلبات الملكية الميكانيكية في سيناريوهات مختلفة ، تم تطوير أنواع متعددة من مواد الهيدروجيل لاستخدامها في بناء الناقلات الصغيرة6،7،8،9،10،11. تعد المواد الهلامية المائية للجينات وحمض الهيالورونيك (HA) من أكثر المواد الحاملة للميكرو استخداما بسبب توافقها الحيوي الجيد وقابليتها للربط المتبادل 12,13. يمكن ربط الجينات بسهولة بواسطة كلوريد الكالسيوم ، ويمكن تعديل خصائصه الميكانيكية عن طريق تغيير وقت الربط المتبادل. يرتبط HA المترافق مع التيرامين عن طريق الاقتران التأكسدي لموييتات التيرامين التي يحفزها بيروكسيد الهيدروجين وبيروكسيديز الفجل14. غالبا ما يستخدم الكولاجين ، بسبب هيكله الحلزوني الفريد وشبكة الألياف المتقاطعة ، كمادة مساعدة للخلط مع الناقلات الدقيقة لزيادة تعزيز ارتباط الخلايا15,16.
تشمل الطرق الحالية لإعداد الناقلات الدقيقة رقائق الموائع الدقيقة ، والطباعة النافثة للحبر ، والرش الكهربائي 17،18،19،20،21،22،23. وقد ثبت أن رقائق الموائع الدقيقة سريعة وفعالة في إنتاج ناقلات دقيقة موحدة الحجم24. ومع ذلك، تعتمد هذه التقنية على تصميم قناة تدفق معقدة وعملية تصنيع25. قد تؤثر درجات الحرارة العالية أو قوى البثق المفرطة أثناء الطباعة النافثة للحبر، فضلا عن المجالات الكهربائية الشديدة في نهج الرش الكهربائي، سلبا على خصائص المادة، وخاصة نشاطها البيولوجي19. إلى جانب ذلك ، عند تطبيقها على مختلف المواد الحيوية والأقطار ، فإن الفوهات المخصصة المستخدمة في هذه الطرق تؤدي إلى تعقيد معالجة محدود وتكلفة عالية ومرونة منخفضة.
لتوفير طريقة مريحة لإعداد microcarrier ، تم تطبيق تقنية طباعة 3D تسمى نفث القوى اللزجة بالقصور الذاتي بالتناوب (AVIFJ) لبناء ناقلات هيدروجيل دقيقة. تستخدم هذه التقنية قوى دافعة لأسفل وضغطا ثابتا يتم توليده أثناء الاهتزاز الرأسي للتغلب على التوتر السطحي لطرف الفوهة وبالتالي تشكيل قطرات. بدلا من القوى الشديدة والظروف الحرارية ، تعمل الإزاحات السريعة الصغيرة مباشرة على الفوهة أثناء الطباعة ، مما يسبب تأثيرا طفيفا على الخصائص الفيزيائية والكيميائية للحبر الحيوي ويوفر جاذبية كبيرة للمواد النشطة بيولوجيا. باستخدام طريقة AVIFJ ، تم تشكيل ناقلات دقيقة من مواد حيوية متعددة بأقطار تتراوح بين 100 و 300 ميكرومتر بنجاح. إلى جانب ذلك ، ثبت أن الناقلات الدقيقة تربط الخلايا جيدا وتوفر بيئة نمو مناسبة للخلايا الملتصقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر البروتوكول الموضح هنا تعليمات لإعداد أنواع متعددة من ناقلات الهيدروجيل الدقيقة وبذر الخلايا اللاحقة. بالمقارنة مع رقاقة الموائع الدقيقة وطرق الطباعة النافثة للحبر ، يوفر نهج AVIFJ لبناء الناقلات الدقيقة مرونة أكبر وتوافقا حيويا. تتيح الفوهة المستقلة استخدام مجموعة واسعة من الفوهات خ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (3212007) ، وبرنامج البحث العلمي لمبادرة جامعة تسينغهوا (20197050024) ، وصندوق نسيم الربيع بجامعة تسينغهوا (20201080760) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (51805294) ، والبرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2018YFA0703004) ، ومشروع 111 (B17026).
Materials
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Human non-small cell lung cancer cell line |
| Bright field microscope | Olympus | DP70 | |
| Confocal microscope | Nikon | TI-FL | |
| Fetal bovine serum, FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Glass micropipettes | sutter instrument | b150-110-10 | |
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| H-DMEM | GIBCO | 11960-044 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Horseradish peroxidase powder | SIGMA | P6782 | |
| Hydrophobic agent | 3M | PN7026 | Follow the manufacturer's instructions and use after dilution |
| Micro-forge device | narishige | MF-900 | |
| Non-essential amino acids, NEAA | GIBCO | 11140-050 | non-essential amino acids |
| Penicillin G and streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Petri dish | SIGMA | P5731-500EA | |
| Puller | sutter instrument | P-1000 | |
| Sodium alginate | SIGMA | A0682 | |
| Trypsin | GIBCO | 25200-056 | |
| Type I collagen solution from rat tail | SIGMA | C3867 |
Riferimenti
- Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic Translation. 3, 51-57 (2015).
- Badenes, S. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A. V., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems. Journal of Biotechnol. 234, 71-82 (2016).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Da Silva, C. L., Cabral, J. M. S. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
- Naqvi, S. M., et al. Living cell factories – electrosprayed microcapsules and microcarriers for minimally invasive delivery. Advanced Materials. 28, 5662-5671 (2016).
- Sarkar, S., et al. Chitosan: A promising therapeutic agent and effective drug delivery system in managing diabetes mellitus. Carbohydrate Polymers. 247, (2020).
- Sulaiman, S. B., Idrus, R. B. H., Hwei, N. M. Gelatin microsphere for cartilage tissue engineering: current and future strategies. Polymers. 12, (2020).
- Huang, L., Abdalla, A. M. E., Xiao, L., Yang, G. Biopolymer-based microcarriers for three-dimensional cell culture and engineered tissue formation. International Journal of Molecular Sciences. 21, (2020).
- Isiklan, N., Tokmak, S. Development of thermo/pH-responsive chitosan coated pectin-graft-poly(N, N-diethyl acrylamide) microcarriers. Carbohydrate Polymers. 218, 112-125 (2019).
- Lau, T. T., Wang, C., Wang, D. A. Cell delivery with genipin crosslinked gelatin microspheres in hydrogel/microcarrier composite. Composites Science & Technology. 70, 1909-1914 (2010).
- Lau, T. T. Hydrogel-microcarrier composite systems for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10, 1646-1662 (2014).
- Kwon, Y. J., Peng, C. A. Calcium-alginate gel bead cross-linked with gelatin as microcarrier for anchorage-dependent cell culture. Biotechniques. 33, 218 (2002).
- Leach, J. B., Bivens, K. A., Patrick, C. W., Schmidt, C. E. Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds. Biotechnology & Bioengineering. 82, 578-589 (2003).
- Kurisawa, M., Chung, J. E., Yang, Y. Y., Gao, S. J., Uyama, H. Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering. Chemical Communications. 34, 4312-4314 (2005).
- Yao, R., Alkhawtani, A. Y. F., Chen, R., Luan, J., Xu, M. Rapid and efficient in vivo angiogenesis directed by electro-assisted bioprinting of alginate/collagen microspheres with human umbilical vein endothelial cell coating layer. International Journal of Bioprinting. 5, 194 (2019).
- Mahou, R., Vlahos, A. E., Shulman, A., Sefton, M. V. Interpenetrating alginate-collagen polymer network microspheres for modular tissue engineering. Acs Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3704-3712 (2017).
- Aftab, A., et al. Microfluidic platform for encapsulation of plant extract in chitosan microcarriers embedding silver nanoparticles for breast cancer cells. Applied Nanoscience. 10, 2281-2293 (2020).
- Park, W., et al. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Chui, C., et al. Electrosprayed genipin cross-linked alginate-chitosan microcarriers for ex vivo expansion of mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 122-133 (2019).
- Min, N. G., Ku, M., Yang, J., Kim, S. Microfluidic production of uniform microcarriers with multicompartments through phase separation in emulsion drops. Chemistry of Materials. 28 (5), 1430-1438 (2016).
- Park, W., Jang, S., Kim, T. W., Bae, J., Lee, E. A. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Xu, T., Kincaid, H., Atala, A., Yoo, J. J. High-Throughput Production of Single-Cell Microparticles Using an Inkjet Printing Technology. Journal of Manufacturing Science & Engineering. 130, 137-139 (2008).
- Rao, W., et al. Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules. Biomaterials. 27 (27), 7762-7773 (2014).
- Choi, C. H., Weitz, D. A., Lee, C. S. One step formation of controllable complex emulsions: From functional particles to simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic agents into desired position. Advanced Materials. 25, 2536-2541 (2013).
- Choi, A., Seo, K. D., Kim, D. W., Kim, B. C., Dong, S. K. Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications. Lab On A Chip. 17 (4), 591-613 (2017).
- Liu, T., Pang, Y., Zhou, Z., Yao, R., Sun, W. An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models. Acta Biomaterialia. 95, 245-257 (2019).
- Hassan, K., et al. Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications. NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).
- Vithani, K., et al. An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems. Pharmaceutical Research. 36, (2019).
