Impressão 3D de Microcarriers de hidrogel in vitro alternando jatos de força viscosa-inercial

Summary

Apresentada aqui é uma técnica de impressão 3D leve impulsionada por forças viscosas-inerciais alternadas para permitir a construção de microcarriers de hidrogel. Bicos caseiros oferecem flexibilidade, permitindo fácil substituição para diferentes materiais e diâmetros. Microcarriers de ligação celular com diâmetro de 50-500 μm podem ser obtidos e coletados para posterior cultivo.

Abstract

Microcarriers são contas com um diâmetro de 60-250 μm e uma grande área de superfície específica, que são comumente usadas como portadores para culturas celulares de grande escala. A tecnologia da cultura microcarrier tornou-se uma das principais técnicas em pesquisa citológica e é comumente usada no campo da expansão celular em larga escala. Microcarriers também têm mostrado desempenhar um papel cada vez mais importante na construção de engenharia de tecidos in vitro e na triagem clínica de medicamentos. Os métodos atuais para preparar microcarriers incluem chips microfluidos e impressão de jato de tinta, que muitas vezes dependem de design complexo de canais de fluxo, uma interface de duas fases incompatível e uma forma de bocal fixo. Esses métodos enfrentam os desafios do processamento complexo do bico, mudanças inconvenientes no bocal e forças excessivas de extrusão quando aplicados a vários bioink. Neste estudo, foi aplicada uma técnica de impressão 3D, chamada de jato de força viscosa-inercial alternada, para permitir a construção de microcarriers de hidrogel com diâmetro de 100-300 μm. As células foram posteriormente semeadas em microcarriers para formar módulos de engenharia de tecidos. Em comparação com os métodos existentes, este método oferece um diâmetro de ponta de bocal gratuito, comutação flexível do bocal, livre controle dos parâmetros de impressão e condições de impressão suaves para uma ampla gama de materiais bioativos.

Introduction

Microcarriers são contas com um diâmetro de 60-250 μm e uma grande área de superfície específica e são comumente usadas para cultura em larga escala de ^células1,2. Sua superfície externa fornece locais de crescimento abundantes para as células, e o interior fornece uma estrutura de suporte para a proliferação espacial. A estrutura esférica também proporciona comodidade no monitoramento e controle de parâmetros, incluindo pH, _O2 e concentração de nutrientes e metabólitos. Quando usados em combinação com bioreatores de tanques agitados, os microcarriers podem alcançar densidades celulares mais altas em um volume relativamente pequeno em comparação com as culturas convencionais, fornecendo assim uma maneira econômica de alcançar culturas em larga ^escala3. A tecnologia da cultura microcarrier tornou-se uma das principais técnicas da pesquisa citológica, e muito progresso tem sido feito no campo da expansão em larga escala de células-tronco, hepatócitos, condrócitos, fibroblastos e outras ^estruturas4. Também foram encontrados veículos ideais de entrega de drogas e unidades de baixo para cima, assumindo, portanto, um papel cada vez mais importante na triagem clínica de medicamentos e reparação de tecido in vitro5.

Para atender aos requisitos de propriedade mecânica em diferentes cenários, vários tipos de materiais hidrogel foram desenvolvidos para uso na construção de microcarriers6,7,8,9,10,11. Os hidrogéis de ácido alginato e hialurônico (HA) são dois dos materiais microcarrier mais utilizados devido à sua boa biocompatibilidade e ^{crosslinkability12,13}. O alginato pode ser facilmente cruzado por cloreto de cálcio, e suas propriedades mecânicas podem ser moduladas alterando o tempo de ligação cruzada. A HA conjugada com tyramina é cruzada pelo acoplamento oxidativo de moieties de tiranaina catalisadas por peróxido de hidrogênio e peroxidase ^{de rabanete14}. O colágeno, devido à sua estrutura espiral única e rede de fibras cruzadas, é frequentemente usado como um adjuvante para se misturar nos microcarriers para promover ainda mais o apego ^celular15,16.

Os métodos atuais de preparação de microcarriers incluem chips microfluidos, impressão a jato de tinta e eletrospray17,18,19,20,21,22,23. Os chips microfluidos têm sido comprovadamente rápidos e eficientes na produção de microcarriers de tamanho ^uniforme24. No entanto, essa tecnologia conta com um complexo processo de design e fabricação de canais de ^fluxo25. Forças de alta temperatura ou extrusão excessiva durante a impressão de jato de tinta, bem como campos elétricos intensos na abordagem eletrospray, podem afetar negativamente as propriedades do material, especialmente sua atividade ^biológica19. Além disso, quando aplicados a diversos biomateriais e diâmetros, os bicos personalizados utilizados nesses métodos resultam em complexidade de processamento limitada, alto custo e baixa flexibilidade.

Para fornecer um método conveniente para a preparação de microcarrier, uma técnica de impressão 3D chamada alternando forças viscosas-inerciais (AVIFJ) foi aplicada para construir microcarriers de hidrogel. A técnica utiliza forças motrizes descendentes e pressão estática gerada durante a vibração vertical para superar a tensão superficial da ponta do bocal e, assim, formar gotículas. Em vez de forças severas e condições térmicas, pequenos deslocamentos rápidos atuam diretamente no bocal durante a impressão, causando um pequeno efeito sobre as propriedades físico-químicas do bioink e apresentando grande atração por materiais bioativos. Utilizando o método AVIFJ, microcarriers de múltiplos biomateriais com diâmetros de 100-300 μm foram formados com sucesso. Além disso, as microcarriers foram comprovadamente mais adequadas para ligar bem as células e proporcionar um ambiente de crescimento adequado para as células aderidas.

Protocol

1. Cultura celular Suplemente o meio essencial mínimo modificado de alta glicose Dulbecco (H-DMEM) com 10% de soro bovino fetal (FBS), 1% solução de aminoácido não essencial (NEAA), 1% penicilina G e estreptomicina, e 1% suplemento de glutamina como mídia cultural para células A549. Cultura A549 células em uma incubadora de CO2 a 37 °C e com 5% de CO2 Células dissociadas para subcultura usando trippsina a aproximadamente 80% de confluência. Use 3 mL …

Representative Results

Foram fabricados cabeçoteiros de variadas taxas de convergência e diâmetros para a impressão de múltiplos tipos de materiais. Os bicos obtidos com o aumento da força de puxar são mostrados na Figura 1B. Os bicos foram divididos em três áreas: reservatório (III), contração (II) e cabeçote de impressão (I). O reservatório era a parte não processada do bocal, na qual o líquido forneceu pressão estática e entrada de bioink para impressão. A área de contração foi a principa…

Discussion

O protocolo descrito aqui fornece instruções para a preparação de multi-tipos de microcarriers de hidrogel e subsequentes semeadura de células. Em comparação com os métodos microfluídicos de impressão de chips e jatos de tinta, a abordagem AVIFJ para a construção de microcarriers oferece maior flexibilidade e biocompatibilidade. Um bocal independente permite que uma ampla gama de bicos leves, incluindo micropipettos de vidro, sejam usados nestes sistemas de impressão. O processamento altamente controlável p…

Materials

A549 cells	ATCC	CCL-185	Human non-small cell lung cancer cell line
Bright field microscope	Olympus	DP70
Confocal microscope	Nikon	TI-FL
Fetal bovine serum, FBS	BI	04-001-1ACS
Gelatin	SIGMA	G1890
Glass micropipettes	sutter instrument	b150-110-10
GlutaMAX	GIBCO	35050-061
H-DMEM	GIBCO	11960-044	Dulbecco's modified eagle medium
Horseradish peroxidase powder	SIGMA	P6782
Hydrophobic agent	3M	PN7026	Follow the manufacturer's instructions and use after dilution
Micro-forge device	narishige	MF-900
Non-essential amino acids, NEAA	GIBCO	11140-050	non-essential amino acids
Penicillin G and streptomycin	GIBCO	15140-122
Petri dish	SIGMA	P5731-500EA
Puller	sutter instrument	P-1000
Sodium alginate	SIGMA	A0682
Trypsin	GIBCO	25200-056
Type I collagen solution from rat tail	SIGMA	C3867