3D-печать микронесущих с гидрогелем in vitro методом чередования вязко-инерционной струйной обработки
Summary
Здесь представлена мягкая техника 3D-печати, управляемая чередующимися вязко-инерционными силами, позволяющая строить гидрогелевые микроносители. Самодельные насадки обеспечивают гибкость, что позволяет легко заменять различные материалы и диаметры. Микроносители клеточного связывания диаметром 50-500 мкм могут быть получены и собраны для дальнейшего культивирования.
Abstract
Микроносители представляют собой шарики диаметром 60-250 мкм и большой удельной площадью поверхности, которые обычно используются в качестве носителей для крупномасштабных клеточных культур. Технология микронесущих культур стала одним из основных методов в цитологических исследованиях и широко используется в области крупномасштабного расширения клеток. Было также показано, что микроносители играют все более важную роль в построении тканевой инженерии in vitro и клиническом скрининге лекарств. Современные методы подготовки микронесущих включают микрофлюидные чипы и струйную печать, которые часто полагаются на сложную конструкцию канала потока, несовместимый двухфазный интерфейс и фиксированную форму сопла. Эти методы сталкиваются с проблемами сложной обработки сопла, неудобными изменениями сопла и чрезмерными экструзионными силами при применении к нескольким биочернам. В этом исследовании был применен метод 3D-печати, называемый чередующимся вязко-инерционным струйным действием, чтобы позволить построить гидрогелевые микроносители диаметром 100-300 мкм. Впоследствии клетки были посеяны на микроносителях для формирования тканевых инженерных модулей. По сравнению с существующими методами, этот метод предлагает свободный диаметр наконечника сопла, гибкое переключение сопел, свободное управление параметрами печати и мягкие условия печати для широкого спектра биологически активных материалов.
Introduction
Микроносители представляют собой шарики диаметром 60-250 мкм и большой удельной площадью поверхности и обычно используются для крупномасштабной культивирования клеток1,2. Их внешняя поверхность обеспечивает обильные участки роста для клеток, а внутренняя обеспечивает опорную структуру для пространственной пролиферации. Сферическая структура также обеспечивает удобство в мониторинге и контроле параметров, включая pH, O2 и концентрацию питательных веществ и метаболитов. При использовании в сочетании с биореакторами с перемешиваемым резервуаром микроносители могут достигать более высокой плотности клеток в относительно небольшом объеме по сравнению с обычными культурами, тем самым обеспечивая экономически эффективный способ получения крупномасштабных культур3. Технология культивирования микроносителей стала одним из основных методов в цитологических исследованиях, и большой прогресс был достигнут в области масштабного расширения стволовых клеток, гепатоцитов, хондроцитов, фибробластов и других структур4. Было также установлено, что они являются идеальными средствами доставки лекарств и блоками снизу вверх, поэтому они играют все более важную роль в клиническом скрининге лекарств и восстановлении тканевой инженерии in vitro5.
Для удовлетворения требований к механическим свойствам в различных сценариях было разработано несколько типов гидрогелевых материалов для использования в строительстве микронесущих6,7,8,9,10,11. Гидрогели альгината и гиалуроновой кислоты (ГК) являются двумя наиболее часто используемыми микронесущими материалами благодаря их хорошей биосовместимости и сшиваемости12,13. Альгинат может быть легко сшит хлористым кальцием, а его механические свойства могут модулироваться путем изменения времени сшивания. Тирамино-конъюгированная ГК сшита окислительной связью фрагментов тирамина, катализируемых перекисью водорода и пероксидазой хрена14. Коллаген, благодаря своей уникальной спиральной структуре и сшитой волоконной сети, часто используется в качестве адъюванта для смешивания с микроносителями для дальнейшего содействия прикреплению клеток15,16.
Современные методы подготовки микроносителей включают микрофлюидные чипы, струйную печать и электрораспыление17,18,19,20,21,22,23. Было доказано, что микрофлюидные чипы быстро и эффективно производят микроносители однородного размера24. Однако эта технология опирается на сложный процесс проектирования и изготовления каналов потока25. Высокая температура или чрезмерные экструзионные силы при струйной печати, а также интенсивные электрические поля при электрораспылительном подходе могут негативно сказаться на свойствах материала, особенно на его биологической активности19. Кроме того, при применении к различным биоматериалам и диаметрам индивидуальные сопла, используемые в этих методах, приводят к ограниченной сложности обработки, высокой стоимости и низкой гибкости.
Чтобы обеспечить удобный метод подготовки микроносителей, для построения гидрогелевых микроносителей был применен метод 3D-печати, называемый струйной обработкой переменных вязко-инерционных сил (AVIFJ). Техника использует нисходящие движущие силы и статическое давление, создаваемое во время вертикальной вибрации, чтобы преодолеть поверхностное натяжение наконечника сопла и, таким образом, сформировать капли. Вместо сильных сил и тепловых условий небольшие быстрые смещения действуют непосредственно на сопло во время печати, оказывая незначительное влияние на физико-химические свойства биочернила и представляя большую привлекательность для биологически активных материалов. С помощью метода AVIFJ были успешно сформированы микроносители из нескольких биоматериалов диаметром 100-300 мкм. Кроме того, было доказано, что микроносители хорошо связывают клетки и обеспечивают подходящую среду роста для прилипших клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь, содержит инструкции по приготовлению многотипных микроносителей гидрогеля и последующему посеву клеток. По сравнению с методами микрофлюидной чиповой и струйной печати, подход AVIFJ к созданию микронесущих обеспечивает большую гибкость и биосовместимость. Н?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Пекинским фондом естественных наук (3212007), Программой научных исследований Инициативы Университета Цинхуа (20197050024), Фондом весеннего бриза Университета Цинхуа (20201080760), Национальным фондом естественных наук Китая (51805294), Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2018YFA0703004) и Проектом 111 (B17026).
Materials
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | Human non-small cell lung cancer cell line |
| Bright field microscope | Olympus | DP70 | |
| Confocal microscope | Nikon | TI-FL | |
| Fetal bovine serum, FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Gelatin | SIGMA | G1890 | |
| Glass micropipettes | sutter instrument | b150-110-10 | |
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| H-DMEM | GIBCO | 11960-044 | Dulbecco's modified eagle medium |
| Horseradish peroxidase powder | SIGMA | P6782 | |
| Hydrophobic agent | 3M | PN7026 | Follow the manufacturer's instructions and use after dilution |
| Micro-forge device | narishige | MF-900 | |
| Non-essential amino acids, NEAA | GIBCO | 11140-050 | non-essential amino acids |
| Penicillin G and streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Petri dish | SIGMA | P5731-500EA | |
| Puller | sutter instrument | P-1000 | |
| Sodium alginate | SIGMA | A0682 | |
| Trypsin | GIBCO | 25200-056 | |
| Type I collagen solution from rat tail | SIGMA | C3867 |
Riferimenti
- Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic Translation. 3, 51-57 (2015).
- Badenes, S. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A. V., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. Microcarrier-based platforms for in vitro expansion and differentiation of human pluripotent stem cells in bioreactor culture systems. Journal of Biotechnol. 234, 71-82 (2016).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Da Silva, C. L., Cabral, J. M. S. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
- Naqvi, S. M., et al. Living cell factories – electrosprayed microcapsules and microcarriers for minimally invasive delivery. Advanced Materials. 28, 5662-5671 (2016).
- Sarkar, S., et al. Chitosan: A promising therapeutic agent and effective drug delivery system in managing diabetes mellitus. Carbohydrate Polymers. 247, (2020).
- Sulaiman, S. B., Idrus, R. B. H., Hwei, N. M. Gelatin microsphere for cartilage tissue engineering: current and future strategies. Polymers. 12, (2020).
- Huang, L., Abdalla, A. M. E., Xiao, L., Yang, G. Biopolymer-based microcarriers for three-dimensional cell culture and engineered tissue formation. International Journal of Molecular Sciences. 21, (2020).
- Isiklan, N., Tokmak, S. Development of thermo/pH-responsive chitosan coated pectin-graft-poly(N, N-diethyl acrylamide) microcarriers. Carbohydrate Polymers. 218, 112-125 (2019).
- Lau, T. T., Wang, C., Wang, D. A. Cell delivery with genipin crosslinked gelatin microspheres in hydrogel/microcarrier composite. Composites Science & Technology. 70, 1909-1914 (2010).
- Lau, T. T. Hydrogel-microcarrier composite systems for cell delivery in tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10, 1646-1662 (2014).
- Kwon, Y. J., Peng, C. A. Calcium-alginate gel bead cross-linked with gelatin as microcarrier for anchorage-dependent cell culture. Biotechniques. 33, 218 (2002).
- Leach, J. B., Bivens, K. A., Patrick, C. W., Schmidt, C. E. Photocrosslinked hyaluronic acid hydrogels: natural, biodegradable tissue engineering scaffolds. Biotechnology & Bioengineering. 82, 578-589 (2003).
- Kurisawa, M., Chung, J. E., Yang, Y. Y., Gao, S. J., Uyama, H. Injectable biodegradable hydrogels composed of hyaluronic acid-tyramine conjugates for drug delivery and tissue engineering. Chemical Communications. 34, 4312-4314 (2005).
- Yao, R., Alkhawtani, A. Y. F., Chen, R., Luan, J., Xu, M. Rapid and efficient in vivo angiogenesis directed by electro-assisted bioprinting of alginate/collagen microspheres with human umbilical vein endothelial cell coating layer. International Journal of Bioprinting. 5, 194 (2019).
- Mahou, R., Vlahos, A. E., Shulman, A., Sefton, M. V. Interpenetrating alginate-collagen polymer network microspheres for modular tissue engineering. Acs Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3704-3712 (2017).
- Aftab, A., et al. Microfluidic platform for encapsulation of plant extract in chitosan microcarriers embedding silver nanoparticles for breast cancer cells. Applied Nanoscience. 10, 2281-2293 (2020).
- Park, W., et al. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Chui, C., et al. Electrosprayed genipin cross-linked alginate-chitosan microcarriers for ex vivo expansion of mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 122-133 (2019).
- Min, N. G., Ku, M., Yang, J., Kim, S. Microfluidic production of uniform microcarriers with multicompartments through phase separation in emulsion drops. Chemistry of Materials. 28 (5), 1430-1438 (2016).
- Park, W., Jang, S., Kim, T. W., Bae, J., Lee, E. A. Microfluidic-printed microcarrier for in vitro expansion of adherent stem cells in 3D culture platform. Macromolecular Bioscience. 19, (2019).
- Xu, T., Kincaid, H., Atala, A., Yoo, J. J. High-Throughput Production of Single-Cell Microparticles Using an Inkjet Printing Technology. Journal of Manufacturing Science & Engineering. 130, 137-139 (2008).
- Rao, W., et al. Enhanced enrichment of prostate cancer stem-like cells with miniaturized 3D culture in liquid core-hydrogel shell microcapsules. Biomaterials. 27 (27), 7762-7773 (2014).
- Choi, C. H., Weitz, D. A., Lee, C. S. One step formation of controllable complex emulsions: From functional particles to simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic agents into desired position. Advanced Materials. 25, 2536-2541 (2013).
- Choi, A., Seo, K. D., Kim, D. W., Kim, B. C., Dong, S. K. Recent advances in engineering microparticles and their nascent utilization in biomedical delivery and diagnostic applications. Lab On A Chip. 17 (4), 591-613 (2017).
- Liu, T., Pang, Y., Zhou, Z., Yao, R., Sun, W. An integrated cell printing system for the construction of heterogeneous tissue models. Acta Biomaterialia. 95, 245-257 (2019).
- Hassan, K., et al. Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications. NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).
- Vithani, K., et al. An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems. Pharmaceutical Research. 36, (2019).
