Diffraction électronique microcristalline de petites molécules
Summary
Nous décrivons ici les procédures développées dans notre laboratoire pour la préparation de poudres de cristaux de petites molécules pour des expériences de diffraction électronique microcristalline (MicroED).
Abstract
Un protocole détaillé pour la préparation d’échantillons de petites molécules pour les expériences de diffraction électronique microcristalline (MicroED) est décrit. MicroED a été développé pour résoudre des structures de protéines et de petites molécules à l’aide d’un équipement standard de cryomicroscopie électronique (cryo-EM). De cette façon, de petites molécules, des peptides, des protéines solubles et des protéines membranaires ont récemment été déterminés à des résolutions élevées. Les protocoles sont présentés ici pour la préparation de grilles de produits pharmaceutiques à petites molécules en utilisant le médicament carbamazépine comme exemple. Les protocoles de dépistage et de collecte des données sont présentés. Des étapes supplémentaires du processus global, telles que l’intégration des données, la détermination de la structure et le raffinement, sont présentées ailleurs. Le temps nécessaire à la préparation des grilles de petites molécules est estimé à moins de 30 min.
Introduction
La diffraction électronique microcristalline (MicroED) est une méthode de cryomicro-microscopie électronique (cryo-EM) pour déterminer les structures de résolution atomique à partir de cristaux de taille inférieureau micromètre 1,2. Les cristaux sont appliqués sur des grilles de microscope électronique à transmission standard (MET) et congelés en plongeant dans de l’éthane liquide ou de l’azote liquide. Les grilles sont ensuite chargées dans un TEM fonctionnant à des températures cryogéniques. Les cristaux sont situés sur la grille et criblés pour la qualité initiale de la diffraction. Les données MicroED à rotation continue sont collectées à partir d’un sous-ensemble des cristaux filtrés, où les données sont enregistrées à l’aide d’une caméra rapide comme film3. Ces films sont convertis en un format cristallographique standard et traités presque à l’identique comme une expérience de cristallographie aux rayons X4.
MicroED a été développé à l’origine pour étudier les microcristaux de protéines 1,2. Un goulot d’étranglement dans la cristallographie des protéines fait pousser de gros cristaux bien ordonnés pour les expériences traditionnelles de diffraction des rayons X synchrotron. Comme les électrons interagissent avec des ordres de grandeur de matière plus forts que les rayons X, les limites de la taille des cristaux nécessaires pour produire une diffraction détectable sont considérablement plus petites5. De plus, le rapport entre les événements de diffusion élastiques et inélastiques est plus favorable pour les électrons, ce qui suggère que des données plus utiles peuvent être collectées avec une exposition globale plus faible5. Des développements constants ont permis de recueillir des données MicroED à partir des microcristaux les plus difficiles 6,7,8,9.
Récemment, MicroED s’est avéré être un outil puissant pour déterminer les structures de produits pharmaceutiques à petites molécules à partir de matériaux apparemment amorphes10,11,12,13. Ces poudres peuvent provenir directement d’une bouteille de réactif acheté, d’une colonne de purification, ou même de l’écrasement d’une pilule en une poudre fine10. Ces poudres semblent amorphes à l’œil, mais peuvent être entièrement composées de nanocristaux ou simplement contenir des traces de dépôts nanocristallins dans une fraction amorphe non cristalline plus grande. L’application du matériau à la grille est facile, et les étapes ultérieures d’identification des cristaux, de criblage et de collecte de données pourraient même être automatisées dans un proche avenir14. Alors que d’autres peuvent utiliser des méthodes différentes pour la préparation des échantillons et la collecte de données, ici les protocoles développés et utilisés dans le laboratoire Gonen pour la préparation d’échantillons de petites molécules pour MicroED et pour la collecte de données sont détaillés.
Protocol
Representative Results
Discussion
La préparation des échantillons est généralement un processus itératif, où des optimisations sont effectuées après des séances de dépistage et de collecte de données. Pour les échantillons de petites molécules, il est souvent prudent de tenter d’abord la préparation de la grille sans décharge luminescente les grilles, car de nombreux produits pharmaceutiques ont tendance à être hydrophobes10,11. Si les grilles ont trop peu de dépôts nanocrist…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le laboratoire Gonen est soutenu par des fonds du Howard Hughes Medical Institute. Cette étude a été soutenue par les National Institutes of Health P41GM136508.
Materials
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen – 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
Riferimenti
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