Mikrokrystalelektrondiffraktion af små molekyler
Summary
Her beskriver vi de procedurer, der er udviklet i vores laboratorium til fremstilling af pulvere af små molekylekrystaller til mikrokrystalelektrondiffraktion (MicroED) eksperimenter.
Abstract
En detaljeret protokol til fremstilling af små molekyleprøver til mikrokrystalelektrondiffraktion (MicroED) eksperimenter er beskrevet. MicroED er udviklet til at løse strukturer af proteiner og små molekyler ved hjælp af standard elektronkryomikroskopi (cryo-EM) udstyr. På denne måde er små molekyler, peptider, opløselige proteiner og membranproteiner for nylig blevet bestemt til høje opløsninger. Protokoller præsenteres her til fremstilling af gitter af småmolekylære lægemidler ved hjælp af lægemidlet carbamazepin som et eksempel. Protokoller til screening og indsamling af data præsenteres. Yderligere trin i den overordnede proces, såsom dataintegration, strukturbestemmelse og forfining, præsenteres andetsteds. Den tid, det tager at forberede de små molekyler, anslås at være mindre end 30 min.
Introduction
Mikrokrystalelektrondiffraktion (MicroED) er en elektronkryomikroskopi (cryo-EM) metode til bestemmelse af atomopløsningsstrukturer fra krystalleri submikrometerstørrelse 1,2. Krystaller påføres standard transmissionselektronmikroskop (TEM) gitter og fryses ved enten at kaste sig ned i flydende ethan eller flydende nitrogen. Gitre indlæses derefter i en TEM, der arbejder ved kryogene temperaturer. Krystaller er placeret på gitteret og screenet for indledende diffraktionskvalitet. Kontinuerlig rotation MicroED-data indsamles fra en delmængde af de screenede krystaller, hvor dataene gemmes ved hjælp af et hurtigt kamera som en film3. Disse film konverteres til et standard krystallografisk format og behandles næsten identisk som et røntgenkrystallografieksperiment4.
MicroED blev oprindeligt udviklet til at undersøge proteinmikrokrystaller 1,2. En flaskehals i proteinkrystallografi vokser store, velordnede krystaller til traditionelle synkrotron røntgendiffraktionseksperimenter. Da elektroner interagerer med stofstørrelsesordener stærkere end røntgenstråler, er begrænsningerne af krystalstørrelsen, der er nødvendige for at producere detekterbar diffraktion, betydeligt mindre5. Derudover er forholdet mellem elastiske og uelastiske spredningshændelser mere gunstigt for elektroner, hvilket tyder på, at mere nyttige data kan indsamles med en mindre samlet eksponering5. Konstant udvikling har gjort det muligt at indsamle MicroED-data fra de mest udfordrende mikrokrystaller 6,7,8,9.
For nylig har MicroED vist sig at være et kraftfuldt værktøj til bestemmelse af strukturerne af lægemidler med små molekyler fra tilsyneladende amorfe materialer10,11,12,13. Disse pulvere kan komme direkte fra en flaske købt reagens, en rensningskolonne eller endda fra at knuse en pille til et fint pulver10. Disse pulvere forekommer amorfe med øjet, men kan enten være helt sammensat af nanokrystaller eller blot indeholde spormængder af nanokrystallinske aflejringer i en større ikke-krystallinsk, amorf fraktion. Anvendelse af materialet på gitteret er let, og de efterfølgende trin med krystalidentifikation, screening og dataindsamling kan endda automatiseres i den nærmeste fremtid14. Mens andre kan bruge forskellige metoder til prøveforberedelse og dataindsamling, er de protokoller, der er udviklet og anvendt i Gonen-laboratoriet til forberedelse af prøver af små molekyler til MicroED og til dataindsamling, detaljeret.
Protocol
Representative Results
Discussion
Prøveforberedelse er typisk en iterativ proces, hvor optimeringer foretages efter sessioner med screening og dataindsamling. For prøver med små molekyler er det ofte klogt først at forsøge gitterforberedelse uden glødafladning af gitterene, da mange lægemidler har tendens til at være hydrofobe10,11. Hvis nettene har for få nanokrystallinske aflejringer, er det en god idé at prøve igen efter første lysafladning af nettene. Det kan være tilfældet, at …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gonen-laboratoriet støttes af midler fra Howard Hughes Medical Institute. Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health P41GM136508.
Materials
| 0.1-1.5mL Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | Any vial or tube will do. |
| Autogrid clips | Thermo-Fisher | 1036173 | Clipped grids are not required for MicroED. They are required for Thermo-Fisher TEMs equipped with an autoloader system. |
| Autogrid C-rings | Thermo-Fisher | 1036171 | |
| Carbamazapine | Sigma | C4024-1G | Any amount will suffice for these experiments |
| CMOS based detector | Thermo-Fisher | CetaD 16M | We used a CetaD 16M, but any detector with rolling shutter mode or sufficiently fast readout is acceptable. |
| Delphi software | Thermo-Fisher | N/A | Software on Thermo-Fisher TEM systems that allows for manual rotation of the sample stage |
| EPU-D software | Thermo-Fisher | N/A | Commercial software for the acquisition of MicroED data |
| Glass cover slides | Hampton | HR3-231 | |
| Glow discharger | Pelco | easiGlow | |
| High PrecisionTweezers | EMS | 78325-AC | Any high precision tweezer will do |
| Liquid nitrogen vessel | Spear Lab | FD-800 | A standard foam vessel for handling specimens under liquid nitrogen – 800mL |
| SerialEM software | UC Boulder | N/A | Free software distributed by D. Mastronarde. Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology |
| TEM grids | Quantifoil/EMS | Q310CMA | Multi-A 300 mesh grids were used here, but any thin carbon grids will work. For these small molecules, we suggest starting with continuous carbon. |
| transmission electron microscope (TEM) | Thermo-Fisher | Talos Arctica | |
| Whatman circular filter paper | Millipore-Sigma | WHA1001090 | 90mm or larger |
Riferimenti
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345 (2013).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data collection in MicroED. Nature Methods. 11 (9), 927-930 (2014).
- Hattne, J., Martynowycz, M. W., Penczek, P. A., Gonen, T. MicroED with the Falcon III direct electron detector. IUCrJ. 6 (5), 921-926 (2019).
- Hattne, J., et al. MicroED data collection and processing. Acta Crystallographica Section A Foundations and Advances. 71 (4), 353-360 (2015).
- Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
- Martynowycz, M. W., et al. MicroED structure of the human adenosine receptor determined from a single nanocrystal in LCP. BioRxiv. , 316109 (2020).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation MicroED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Martynowycz, M. W., Gonen, T. Ligand incorporation into protein microcrystals for MicroED by on-grid soaking. Structure. , (2020).
- Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).
- Jones, C. G., et al. The CryoEM method MicroED as a powerful tool for small molecule structure determination. ACS Central Science. 4 (11), 1587-1592 (2018).
- Dick, M., Sarai, N. S., Martynowycz, M. W., Gonen, T., Arnold, F. H. Tailoring tryptophan synthase TrpB for selective quaternary carbon bond formation. Journal of the American Chemical Society. 141 (50), 19817-19822 (2019).
- Gallagher-Jones, M., et al. Sub-ångström cryo-EM structure of a prion protofibril reveals a polar clasp. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (2), 131-134 (2018).
- Ting, C. P., et al. Use of a scaffold peptide in the biosynthesis of amino acid-derived natural products. Science. 365 (6450), 280-284 (2019).
- de la Cruz, M. J., Martynowycz, M. W., Hattne, J., Gonen, T. MicroED data collection with SerialEM. Ultramicroscopy. 201, 77-80 (2019).
- Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Kabsch, W. XDS. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).
- Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D. 74 (2), 85-97 (2018).
- de la Cruz, M. J., et al. Atomic-resolution structures from fragmented protein crystals with the cryoEM method MicroED. Nature Methods. 14 (4), 399-402 (2017).
- Shi, D., et al. The collection of MicroED data for macromolecular crystallography. Nature Protocols. 11 (5), 895-904 (2016).
- Nannenga, B. L., Shi, D., Hattne, J., Reyes, F. E., Gonen, T. Structure of catalase determined by MicroED. eLife. 3, 03600 (2014).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Qualitative Analyses of Polishing and Precoating FIB Milled Crystals for MicroED. Structure. 27 (10), 1594-1600 (2019).
