İnsan Hücrelerinde Protein-Ligand Etkileşimlerinin Yüksek Hücre Yoğunluklu Biyoreaktör Kullanarak Gerçek Zamanlı Kantitatif Hücre İçi NMR ile İzlenmesi

Summary

Bu protokol, kapsüllenmiş insan hücrelerini 72 saate kadar canlı tutmak için bir NMR biyoreaktörünün kurulumunu ve ardından zamanla çözülmüş hücre içi NMR veri toplama ve analizini açıklar. Metodoloji, hücre içi protein-ligand etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak izlemek için uygulanır.

Abstract

Hücre içi NMR, biyolojik makromoleküllerin yapısal ve dinamik özelliklerini atomik çözünürlükte doğrudan canlı hücrelerde gözlemlemek için benzersiz bir yaklaşımdır. Protein katlanması, kimyasal modifikasyonlar ve ligand bağlanmasının neden olduğu konformasyonel değişiklikler gözlenebilir. Bu nedenle, bu yöntem ilaç geliştirme bağlamında büyük bir potansiyele sahiptir. Bununla birlikte, NMR spektrometresinde sınırlı insan hücrelerinin kısa ömrü, hücre içi NMR’nin uygulama aralığını sınırlar. Bu sorunun üstesinden gelmek için, zaman içinde hücre numunesi stabilitesini büyük ölçüde artırabilen ve daha da önemlisi, hücre içi NMR spektrumlarının gerçek zamanlı olarak kaydedilmesini sağlayan NMR biyoreaktörleri kullanılır. Bu şekilde, ligand penetrasyonu ve hücre içi protein hedefine bağlanma gibi süreçlerin evrimi gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Biyoreaktörler genellikle yüksek hücre sayılarında düşük hücre canlılığı ile sınırlıdır, bu da deneyin genel duyarlılığı ile hücre canlılığı arasında bir denge ile sonuçlanır. Son zamanlarda, 72 saate kadar uzun süre metabolik olarak aktif olan çok sayıda insan hücresini koruyan bir NMR biyoreaktörü bildirdik. Bu kurulum, protein-ligand etkileşimlerini ve protein kimyasal modifikasyonunu izlemek için uygulandı. Ayrıca, çok değişkenli eğri çözünürlüğüne dayanan gerçek zamanlı NMR verilerinin nicel analizi için bir iş akışı sunduk. Yöntem, hücrelerde bulunan kimyasal türlerin konsantrasyon profillerini, zamanın bir fonksiyonu olarak sağlar ve bu da ilgili kinetik parametreleri elde etmek için daha fazla analiz edilebilir. Burada, NMR biyoreaktör kurulumunun ve insan hücrelerinde protein-ligand etkileşimlerinin izlenmesine uygulanmasının ayrıntılı bir tanımını sunuyoruz.

Introduction

Hücre İçi Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) spektroskopisi son zamanlarda makromoleküllerin hücresel ortamdaki yapısal ve dinamik özelliklerini araştırmak için güçlü bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır1,2,3,4,5,6. Hücre içi NMR, protein katlama/yanlış katlama7,8,9, ^{metal bağlama7,10}, disülfit bağ oluşumu11,12 ve protein-protein etkileşimi13, protein-ligand ^{etkileşimi14,15,16} ve nükleik asit-ligand ^{etkileşimi17} gibi işlevsel olarak ilgili süreçlerin araştırılmasında başarılı olmuştur. ^,18 canlı insan hücrelerinde. Hücre içi NMR uygulamalarının sınırlayıcı faktörlerinden biri, deney sırasında hücrelerin kısa ömürlü olmasıdır. Bu sorunun çözümü, NMR biyoreaktörlerinin kullanılmasını içerir. Bu cihazlarda, oksijen ve besin maddeleri sağlamak ve toksik yan ürünleri uzaklaştırmak için NMR spektrometresi içinde sınırlı tutulan hücrelere sabit bir büyüme ortamı akışı uygulanır. Hücre içi NMR’nin ortaya çıkışını takiben, bakteri veya memeli hücrelerinin bir ^{hidrojel içinde} kapsüllendiği veya süspansiyonda tutulduğu ve bir mikrodiyaliz zarı kullanılarak perfüze edildiği daha uzun süre hücre canlılığını artırmak için çeşitli NMR biyoreaktör tasarımları ^{geliştirilmiştir23} . Bu tür biyoreaktörler, sinyal-gürültü oranı (S/N)⁵ ile daha uzun NMR deneylerinin elde edilmesine olanak sağlamıştır ve daha da önemlisi, hücresel süreçleri gerçek zamanlı olarak araştırmak için ^{kullanılabilir22,23,24}. NMR’nin yüksek kimyasal ve konformasyonel duyarlılığı sayesinde, ikinci uygulama atomik çözünürlükte canlı hücrelerdeki fonksiyonel süreçlerin kinetiği hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.

Bu protokolde, yakın zamanda rapor ^edilen25 geliştirilmiş bir biyoreaktörün nasıl kurulacağını ve çalıştırılacağını gösteriyoruz; bu, mevcut bir modüler biyoreaktör ^{tasarımının23} diğer gruplar tarafından öncülük edilen hidrojeldeki hücre kapsüllemesine dayanan yaklaşımla birleştirilmesiyle elde edilmiştir19,20,21,22,26,27 . Biyoreaktörün, HEK293T hücrelerinde hücre içi protein-gözlem ligand bağlanmasının gerçek zamanlı hücre içi NMR çalışmalarına uygulanmasını açıklıyoruz. Biyoreaktörde, hücreler agaroz jel ipliklerinde yüksek yoğunlukta kapsüllenir ve gerçek zamanlı hücre içi NMR deneylerinin kaydedildiği 72 saate kadar yüksek oranda canlı ve metabolik olarak aktif tutulur. Biyoreaktör, su geçirmez ve bir tüp tutucuya bağlı standart 5 mm NMR problarına uyan bir cam tüpten oluşur, böylece iç numune odası 4,2 mm iç çapa, 38 mm yüksekliğe ve 526 μL’lik bir hacme sahiptir. Giriş, numune odasına alttan ~6 mm’ye kadar yerleştirilen 7 metre uzunluğunda bir PEEK kılcal damarıdır (o.d. = 1/32″, yani = 0,5 mm), çıkış ise tüp tutucunun üstüne tutturulmuş 7 metre uzunluğunda bir PTFE kılcal damardır (o.d. = 1/32″, yani = 0,5 mm) (Şekil 1). Boru, bir su banyosuna bağlı sıcaklık kontrollü bir hatta koaksiyel olarak yerleştirilir. Giriş ve çıkış, PEEK borusu aracılığıyla, orta debiyi ve bir atık kabını kontrol etmek için bir FPLC pompasına bağlı 4, 2 konumlu bir valfe bağlanır.

Biyoreaktör, daha önce bildirilen etkileşimin kinetiğini incelemek için ^{uygulanır14,25}, iki ilaç, asetazolamid (AAZ) ve metazolamit (MZA), insan karbonik anhidrazın (CA II) ikinci izoformu olan insan hücrelerinde, farmakolojik olarak ilgili bir hedef28,29,30 ve küçük molekül ^ebselen25 tarafından teşvik edilen intramoleküler disülfit bağının oluşumunun kinetiği^{, 31}, insan bakırının bakırsız, çinkoya bağlı formundan çinko süperoksit dismutaz (SOD1), amiyotrofik lateral sklerozun başlangıcında rol oynayan bir antioksidan enzim7,8,32. Son olarak, gerçek zamanlı NMR verilerinin nicel analizi, MATLAB’da, gözlemlenen türler için saf spektral bileşenlerin ve zamanın bir fonksiyonu olarak konsantrasyon profillerinin elde edildiği, ilgili kinetik parametrelerin elde edilmesi için daha fazla analiz edilebilen Çok Değişkenli Eğri Çözünürlüğü-Alternatif En Küçük Kareler (MCR-ALS) ^{algoritması33} kullanılarak gerçekleştirilir.

Protokol, HEK293T hücrelerinin T75 şişesinden (şişe başına ~ 3 x ¹⁰⁷ hücre) başlar ve geçici olarak insan CA II (etiketsiz) veya insan SOD1’i (^15N etiketli) aşırı ifade eder. Hücreler, DMEM yüksek glikozlu T75 şişelerinde her 3-4 günde bir 1:10 pasajla büyütüldü ve muhafaza edildi ve deneyden 48 saat önce ilgili proteini kodlayan cDNA ile transfekte edildi. Bu aşamada yer alan adımlar başka bir yerde ayrıntılı olarak ^{bildirilmiştir34}.

Protocol

1. Reaktif ve çözüm kurulumu Tam DMEM hazırlamak için, 440 mL DMEM’e 5 mL L-glutamin 200 mM, 5 mL penisilin-streptomisin 100x ve 50 mL fetal sığır serumu (FBS,% 10 hacim / hacim nihai konsantrasyonu) ekleyin.NOT: Bu çözelti 1 ay boyunca 4 °C’de saklanabilir. % 1.5’lik bir çözelti elde etmek için 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 150 mg düşük jelleşen agarozu 85 ° C’de çözerek agaroz çözeltisi hazırlayın. 0,22 μm filtre ile filtreleme ile sterilize edin. 1.5 mL kapaklı tüplerde 1 mL agaroz çözeltisi alikotu hazırlayın ve 4 ° C’de saklayın. Biyoreaktör ortamını hazırlayın. 13.4 g DMEM tozunu 1 L ultra saf H2O içinde çözün.NOT: Uygulamaya bağlı olarak, gerekli nihai hacim farklılık gösterebilir (örneğin, 500 mL ortam için, 6,7 g tozu 500 mL H2O içinde çözün). % 2 FBS, 10 mM NaHCO3, 1x penisilin-streptomisin (100x) ve% 2 D2O ekleyin (örneğin, 500 mL ortam için 10 mL FBS, 0,4 g NaHCO3, 5 mL penisilin-streptomisin 100x ve 10 mL D2O ekleyin). Bir pH metre kullanarak pH’ı ölçün ve gerekirse HCl ekleyerek 7,4’e ayarlayın.NOT: Tipik olarak, başlangıçtaki pH 7.4’e çok yakındır. Biyoreaktör ortamını vakumla çalışan steril bir filtreyle steril 250 mL veya 500 mL cam şişede filtreleyin. Laminer akış başlığında, şişeyi iki hortum nozullu steril bir çelik başlıkla kapatın ve bunları pompaya ve hava girişi için 0,22 μm PTFE şırınga filtresine bağlanacak bir FEP borusuna (o.d. = 1/8″, yani 1,6 mm) bağlayın. 2. Biyoreaktör kurulumu Akış ünitesini, daha sonra hücreleri içeren batarya ile değiştirilecek olan ikinci bir akış ünitesi NMR tüpü kullanarak birleştirin. Doğru montaj için akış ünitesi çalıştırma talimatlarına bakın.NOT: Bu noktada akış ünitesi zaten temizlenmiş olmalıdır (değilse, adım 4.2’yi gerçekleştirin). Akış ünitesi sıcaklık kontrolüne bağlı su banyosunu 37 °C’ye ayarlayın. Rezervuar şişesini su banyosuna yerleştirin. Rezervuar şişesinin FEP borusunu pompaya bağlayın. Biyoreaktör valfini “atlamaya” çevirin ve pompayı ortamla önceden doldurun. Biyoreaktör valfini “akışa” çevirin ve biyoreaktörü 0,1 mL / dak’da ortamla doldurun. 3. Hücre örneğinin hazırlanması CO2 inkübatöründen hücreleri toplayın. CO2 inkübatöründen transfekte HEK293T hücrelerinin bir T75 şişesini alın ve harcanan ortamı çıkarın. Hücreleri oda sıcaklığında (~ 20 ° C) 7 mL (her biri) PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri ayırmak için 2 mL tripsin / EDTA kullanın. Çözeltiyi ekledikten sonra, hücreleri ayırmak için oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.NOT: Transfekte hücrelerin ayrılması biraz daha uzun sürebilir. Gerekirse, hücreleri 37 ° C’de inkübe edin. 20 mL tam DMEM ile tripsin devre dışı bırakın; Hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyerek, iyice yeniden askıya alın ve 50 mL’lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g’da santrifüj edin ve süpernatanı atın. Artık ortamı çıkarmak için hücreleri oda sıcaklığında 10 mL PBS ile yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g’da santrifüj edin ve süpernatanı atın. Hücre peletini 1,5 mL kapaklı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri agaroz ipliklerine gömün. Bir su banyosunda 85 ° C’de katılaşmış agarozun bir alikotunu eritin ve daha sonra bir blok ısıtıcıda 37 ° C’de çözelti içinde saklayın. Bir Pasteur pipet ile, akış ünitesi NMR tüpünün tabanını 60-70 μL% 1,5 agaroz jeli ile doldurun ve buza yerleştirin. Bu, hücre örneğinin 1H NMR bobininin aktif hacmine yerleştirilmesine izin veren ~ 5 mm yüksekliğinde bir alt fiş oluşturacaktır. Adım 3.1.8’de elde edilen hücrelerin peletini termoblokta 15−20 s için 37 ° C’de ısıtın. 450 μL agaroz çözeltisindeki hücreleri yeniden askıya alın. Kabarcık oluşumunu önlemek için dikkatli olun. Hücre-agaroz süspansiyonunu, 1 mL’lik bir şırıngaya bağlı ~ 30 cm uzunluğunda bir kromatografi PEEK borusuna (yani = 0.75 mm) aspire edin.NOT: Aspirasyondan önce, kabarcık oluşumunu önlemek için şırınganın borusu ve ölü hacmi, oda sıcaklığında PBS ile önceden doldurulmalıdır. Borunun uzunluğu kritik değildir. Boruyu oda sıcaklığında 2 dakika soğumaya bırakın. Akış ünitesi NMR tüpünü oda sıcaklığında 100 μL PBS ile önceden doldurun. Agaroz içine gömülü hücrelerin ipliklerini, şırıngayı hafifçe iterek akış ünitesi NMR tüpüne dökün.NOT: NMR tüpünü homojen bir şekilde doldurmak için, PEEK borusunun ucunu NMR tüpünün altına yerleştirerek başlayın ve yavaşça sola sağa sallanırken üste doğru ilerleyin. Tüm hücre agarozu süspansiyonu atılana kadar 3.2.5, 3.2.6 ve 3.2.8 adımlarını tekrarlayın. Biyoreaktöre hücreler yerleştirin. Boş NMR tüpünü akış ünitesinden çıkarın ve giriş borusundaki artık gaz kabarcıklarını gidermek için akış hızını birkaç dakika boyunca 2 mL / dak’ya yükseltin. Akış hızını 0,2 mL / dak’ya ayarlayın ve hücreleri içeren NMR tüpünü yavaşça ama istikrarlı bir şekilde yukarı doğru iterek yerleştirin.NOT: Ortamın aktif akışı, tüp içeriğinin girişten geri akışını önler, aksi takdirde yerleştirme sırasında meydana gelir. 4. Biyoreaktör çalışması ve temizliği NMR deneyi sırasında biyoreaktör çalışması. NMR spektrometresindeki sıcaklığı 310 K’ya ayarlayın. Akış birimini spektrometreye yerleştirin. Biyoreaktör ortamını, hücre içi NMR deneylerinin tüm süresi boyunca 0,1 mL / dak akış hızında besleyin. Deney sırasında istenen zamanda, silikon boruyu steril bir uzun iğneli şırınga ile delerek orta rezervuar şişesine konsantre bir dış molekül çözeltisi enjekte edin.NOT: Ortamdaki molekülün nihai konsantrasyonu, hücre toksisitesi hakkındaki önceki bilgilere ve eğer varsa, hücre zarı boyunca öngörülen / tahmin edilen difüzyon hızına dayanarak seçilmelidir. NMR deneyinin sonunda, hücreleri içeren tüpü boş bir tüple değiştirin ve akış birimini suyla durulayın. Biyoreaktör yerinde temiz. Aşağıdaki çözeltileri 1 mL/dak’da akıtarak akış ünitesini temizleyin: 0,2 M sodyum hidroksit (NaOH); 3 M sitrik asit; 0,2 M NaOH, her biri en az 30 dakika, ardından >2 saat boyunca steril filtrelenmiş ultra saf su. Her çalıştırmadan sonra rezervuar şişesini ve boru tertibatını temizleyin ve otoklavlayın. 5. NMR deneyleri NMR deneylerinin kurulumu.NOT: Hücre toplama ve veri toplama arasında herhangi bir gecikmeyi önlemek için, hücre içi NMR örneğinin hazırlanmasından önce bu adımları önceden gerçekleştirin. NMR spektrometresinde yeni bir veri kümesi oluşturun ve istenen NMR deneyleri için parametreleri ayarlayın. 1D 1H NMR denemeleri için parametreleri ayarlayın. 1H taşıyıcı frekansını su sinyalinde 4,7 ppm’de ortalayın. Zgesgp darbe programını seçin, spektral genişliği 20 ppm’ye ve su bastırma için 1.000-μs 180 ° kare darbeye ayarlayın. Taramalar arası gecikmeyi 1 sn olarak ayarlayın. 32 tarama ile spektrumu elde edin. Etiketlenmemiş CA II’yi ifade eden hücreler için: p3919gp darbe programını seçin, spektrumun imino bölgesini kapsayacak şekilde spektral genişliği 30 ppm’ye ayarlayın ve binom su bastırma gecikmesini ayarlayın, böylece maksimum uyarılma ilgili sinyallerin kimyasal kaymalarında merkezlenir (d7 = 950 MHz’de 20 μs). Taramalar arası gecikme süresini ≥1 sn olarak ayarlayın. 512 tarama ile edinin. 15N etiketli SOD1’i ifade eden hücreler için: sfhmqf3gpph darbe programını seçin, 1H ve 15N spektral genişliklerini sırasıyla 16 ve 50 ppm’ye, şekilli darbe ofseti ve uyarma bant genişliğini sırasıyla 8,5 ve 6 ppm’ye ve ayırma şeması için 350 μs darbeyi ayarlayın (cihaza bağlı olarak garp4 veya diğer). Taramalar arası gecikmeyi 0,3 sn olarak ayarlayın. 15N boyutunda 16 tarama ve 128 artışla edinin. Gerçek zamanlı NMR spektrum alımı. Biyoreaktör NMR spektrometresine yerleştirildikten sonra, ortamın değişimine izin vermek için birkaç dakika bekleyin.NOT: PBS, %2 D2O içeren bir ortamla değiştirildiği için bu işlem kilit sinyalinin ortaya çıkmasından kolayca izlenir. 1H kanalının eşleşmesini ve ayarını ayarlayın, mıknatısı şime edin ve 1H 90 ° sert darbe uzunluğunu hesaplayın. Her darbe dizisindeki 1H güç seviyelerini 1H sert darbeye göre ayarlayın. Numune içeriğini ve alan homojenliğini kontrol etmek için ilk zgesgp 1H spektrumunu kaydedin. Zgesgp ve p3919gp/sfhmqcf3gpph deneylerini istenen sayıya kopyalayın ve bunları edinme biriktiricisinde sıraya koyun.NOT: Zgesgp spektrumları yalnızca numunenin durumunu ve alan homojenliğini kontrol etmek için kullanılır; bu nedenle, atlanabilir veya daha az sıklıkta kaydedilebilirler. Etiketsiz CA II’yi ifade eden hücreler için: sıfır doldurma ve üstel çizgi genişletme penceresi işlevi (LB = 20 Hz) uygulayarak p3919gp spektrumlarını işleyin. 15N etiketli SOD1’i ifade eden hücreler için: her iki boyutta da sıfır doldurma ve kare sinüs çanı pencere fonksiyonu (SSB = 2) uygulayarak sfhmqcf3gpph spektrumlarını işleyin.NOT: İşlenen spektrumların boyutu, sinyalsiz bölgeler kaldırılarak daha da azaltılabilir (Topspin’de bu, istenen STSR ve STSI değerleri ayarlanarak yapılır). 6. MCR-ALS analizi CA II spektrumlarının analizi için, MATLAB R2019b’de 1B spektral bölgeleri içe aktarın. Yazılımda, İşlem Veri Kümesi Listesi menüsünde dışa aktarılacak deneylerin bir listesini oluşturun. au programının değiştirilmiş bir sürümünü kullanarak convbin2asc, ilgilenilen spektral bölgeyi her spektrum için ASCII biçiminde dışa aktarın.Not: Bu, her spektrum alt dizininde ascii-spec.txt adlı bir metin dosyası oluşturur. MATLAB’da, Load_ascii_spectra özel komut dosyasını kullanarak spektral bölgeleri içeri aktarın.NOT: Bu betik, veri kümesi dizinini giriş olarak gerektirir ve yığılmış 1B spektrumları içeren bir 2B dizi spektrumu ve kimyasal kaymaları içeren bir 1B dizi cs üretir. 1B spektrumlardan zaman damgalarını ayıklamak için Load_acqus komut dosyasını çalıştırın.NOT: Bu komut dosyası, saat cinsinden ifade edilen her spektrum için zaman artışını içeren bir 1B dizi times_hours üretir ve zamandaki başlangıç spektrumu = 0’dır. SOD1 spektrumlarının analizi için, MATLAB R2020b’de 2D spektrumları içe aktarın. Topspin’de, İşlem Veri Kümesi Listesi menüsünde dışarı aktarılacak deneylerin bir listesini oluşturun. MATLAB’da, Load_2D_spectra özel komut dosyasını kullanarak 2B spektrumları içe aktarın.NOT: Bu betik, veri kümesi dizinini giriş olarak gerektirir ve yığılmış 2B spektrumları içeren bir 3B dizi Spectra ve kimyasal kaymaları içeren bir 1D dizi cs üretir. 2B spektrumlardan zaman damgalarını çıkarmak için Load_acqus komut dosyasını çalıştırın. Özel komut dosyası Cut_2D_spectra ilgilenilen spektral bölgeleri belirtin ve 3B alt dizileri [(1H x 15N) spektral yoğunlukları) x zaman] kesmek için betiği çalıştırın; bunları 2B diziler (zaman noktaları x spektral yoğunluklar) olarak yeniden şekillendirin ve bir araya getirin.NOT: Bu, yeniden şekillendirilmiş ve birleştirilmiş spektral bölgeleri içeren bir 2B dizi JoinSpec_flat üretir. MCR-ALS 2.0’ı GUI modunda çalıştırın. mcr_main komut dosyasını çalıştırarak MCR-ALS 2.0 GUI’sini açın. Veri Seçimi sekmesinde, spektrumları veya JoinSpec_flat matrisini yükleyin. Veriler kontrol için çizilebilir. Bileşenlerin sayısını Tekil Değer Ayrıştırma (SVD) ile veya el ile değerlendirin.NOT: Bileşenlerin sayısı, deneyde bulunan farklı türlerin sayısına karşılık gelmelidir. Bu durumda n = 2, serbest ve bağlı proteine karşılık gelir. Saf spektrumların ilk tahmini için bir yöntem seçin. En saf değişken tespiti veya Gelişen Faktör Analizi (EFA) kullanılabilir. Veri Kümesi penceresinin Seçimi’nde Devam’ı seçin. Kısıtlamalar: Satır Modu penceresinde konsantrasyonlar için kısıtlamaları ayarlayın. Olumsuzluk olmayan bir kısıtlama uygulayın, “uygulama ve 2 tür” olarak fnnl’leri (Hızlı olumsuzluk kısıtlamalı en küçük kareler) seçin. 1 kapatma kısıtlaması uygulayın, kısıtlamayı 1, kapatma koşulunu “eşittir” olarak ayarlayın ve tüm türlere uygulayın.NOT: Bu, her bir türün konsantrasyonlarının toplamını 1’e eşit olmaya zorlar, böylece her türün elde edilen profilleri toplam protein konsantrasyonuna göre normalleştirilir. Kısıtlamalar: Sütun Modu penceresinde spektrumlar için kısıtlamaları ayarlayın. Olumsuzluk olmayan bir kısıtlama uygulayın, fnnls’yi “uygulama ve 2 tür” olarak seçin.NOT: NMR spektrumlarında negatif sinyaller varsa bu kısıtlama uygulanmamalıdır. Son pencerede, 50 yineleme ve 0,01 yakınsama ölçütü ayarlayın. Konsantrasyonlar, Spektrumlar ve Std. sapması için çıktı adlarını belirtin. MCR-ALS donanımını çalıştırmak için Devam’a tıklayın.NOT: Grafik bir pencere, konsantrasyon profillerinin grafikleri ve saf bileşenlerin spektrumları ile bağlantı kurma sonucunu gösterecektir. SOD1 veri kümesi için: MCR-ALS’nin 1B çıktısından 2B spektral bölgeleri yeniden oluşturmak ve bunları çizmek için özel betik Rebuild_2D_spectra kullanın. 7. Tripan mavi testi NMR tüp içeriğini bir Pasteur pipet ile geri kazanın ve agaroz ipliklerini 1,5 mL kapaklı bir tüpe aktarın. Agaroz ipliklerini 600 μL PBS ile durulayarak artık ortamı çıkarın ve oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 4.000 x g’de santrifüj yapın. Süper natantı atın. 250 μL PBS ve 50 μL %0,4 Tripan mavisi çözeltisi ekleyin. Sürekli pipetleme ile 2 dakika boyunca inkübe edin. Süper natantı atmak için 600 μL PBS ile iki kez yıkayın. Bir mikroskop sürgüsüne birkaç agaroz ipliği yerleştirin ve küçük jel dilimleri oluşturmak için tıraş bıçağı ile doğrayın. Analiz için en ince dilimleri (kalınlık < 0,4 mm, ideal olarak ~ 0,2 mm) seçin. Jel dilimlerini, her iki tarafta üç kat parafin film (~ 0.4 mm toplam kalınlık) ile aralıklı iki cam slayttan oluşan kendi kendine yapılan bir hücre sayma odasına aktarın.NOT: Bir hazne sürgüsü de kullanılabilir; Bununla birlikte, jel dilimleri oda yüksekliğinden (0.1 mm) daha kalın sıkılır ve gömülü hücreler kopar. Agarozun içindeki hücrelerin görüntülerini elde edin ve beyaz ve mavi hücreleri sayın. Hücre canlılığını (toplam hücreler – mavi hücreler) / toplam hücreler olarak hesaplayın.

Representative Results

Yukarıdaki protokol, gerçek zamanlı hücre içi süreçlerde araştırmak için gerekli olan uzun süre hücre canlılığını en üst düzeye çıkarmak için hücrelerin hidrojel ipliklerinde kapsüllenmesine izin verir. Biyoreaktörde, hücreler canlı tutulur ve Trypan mavi testi ile doğrulandığı gibi 72 saate kadar metabolik olarak aktif tutulur (Şekil 2a-c). Prensip olarak, bu protokol, herhangi bir konformasyonel veya kimyasal değişikliğe uğrayan ilgili bir hücre içi proteini gözlemlemek için uygulanabilir. Yukarıda açıklanan ilk uygulamada, biyoreaktör, HEK293T hücrelerinin sitozolünde aşırı eksprese edilen iki inhibitör, AAZ ve MZA’nın CA II’ye bağlanmasını gerçek zamanlı olarak izlemek için uygulanır. Kaydedilen ilk 1H uyarma şekillendirme spektrumu (zgesgp), genel sinyal yoğunluğunu (hücre sayısıyla orantılı), aşırı eksprese edilen proteinden gelen sinyallerin varlığını ve alan homojenliğini değerlendirmek için kullanılır (Şekil 2d). CA II durumunda, iki inhibitörün hücre içi bağlanması, 11 ila 16 ppm arasındaki bölgedeki 1H sinyallerini gözlemleyerek, WATERGATE 3-9-1935 1D 1H NMR spektrumları (p3919gp) ile izlenebilir. Bu sinyaller, CA II36’nın çinko koordine edici histidinlerinden ve diğer aromatik kalıntılarından kaynaklanır ve ligand bağlanması üzerine bozulur14,15. Ligand konsantrasyonları, difüzyon hızına göre veya varsa önceden belirlenmiş geçirgenlik değerlerine göre seçilebilir14. Başarılı bağlanma, ilgilenilen spektral bölgede yavaş yavaş orijinal sinyallerin yerini alan ek bir sinyal kümesinin ortaya çıkmasıyla görsel olarak doğrulanır (Şekil 3). Zamana bağlı bağlanma eğrileri, serbest ve bağlı CA II’den kaynaklanan iki NMR sinyali kümesini ayıran (Şekil 4a) ve aynı anda iki türün göreceli konsantrasyon profillerini sağlayan MCR-ALS analizi ile elde edilir (Şekil 4b). İkinci uygulamada, biyoreaktör, insan hücrelerinde bir glutatyon peroksidaz mimetik olan ebselen tarafından teşvik edilen çinkoya bağlı SOD1 intramoleküler disülfit bağının oluşumunu izlemek için uygulanır. Bu süreç, disülfit bağ oluşumunun neden olduğu protein yapısının bozulmalarının neden olduğu 1H-15N 2D SOFAST-HMQC37 spektrumlarındaki (protein omurga konformasyonunun parmak izini sağlayan) değişiklikler gözlemlenerek izlenir. Disülfür oksitlenmiş SOD1’den kaynaklanan ek sinyaller 1H-15N spektrumunda görünür ve yavaş yavaş disülfür indirgenmiş SOD1’den gelenlerin yerini alır. 2D spektrumun seçilmiş bölgeleri üzerinde MCR-ALS analizi, iki türden kaynaklanan sinyalleri ayırır (Şekil 5a) ve göreceli konsantrasyon profillerini sağlar (Şekil 5b). Elde edilen konsantrasyon eğrileri, incelenen süreçlerin kinetiği hakkında bilgi sağlamak için doğrusal olmayan uydurma ile daha fazla analiz edilebilir25. Resim 1: Biyoreaktörün şeması. Solda: boş akış biriminin kesit görünümü. Sağda: biyoreaktör kurulumunun şeması. PEEK giriş borusu yeşil renkle gösterilmiştir; PTFE çıkış borusu mavi renkle gösterilmiştir. Sol panel Luchinat ve ark.25’in izniyle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Kapsüllenmiş hücreler üzerinde Tripan Mavi Testi ve 1H NMR ile numune kontrolü. Gömülü hücreler içeren ve Tripan mavisi ile boyanmış (a) dökümden hemen sonra ve (b) biyoreaktörde 72 saat sonra boyanmış temsili agaroz dilimleri; (c) NMR biyoreaktöründe aktif akış altında (siyah) ve statik koşullar altında (kırmızı) zamanın bir fonksiyonu olarak hücre canlılığı, Tripan Mavi Testi ile ölçülmüştür. (d) biyoreaktördeki gaz kabarcıklarının yokluğunda (siyah) ve varlığında (kırmızı) CA II’yi aşırı eksprese eden agaroz gömülü hücrelere kaydedilen zgesgp 1H NMR spektrumları. İkinci durumda, azalan homojenliği çizgi genişlemesine ve solvent baskılama artefaktlarının ortaya çıkmasına neden olur. İlginç spektral özellikler etiketlenmiştir. Paneller (a-c) Luchinat ve ark.25’in izniyle çoğaltılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Biyoreaktördeki agaroz kapsüllenmiş hücreler üzerinde elde edilen temsili gerçek zamanlı hücre içi 1H NMR verileri. CA II’yi aşırı eksprese eden HEK293T hücrelerinin 1D 1H NMR spektrumlarının (15.6 ila 11.1 ppm arasındaki bölge) şelale grafikleri ve daha sonra NMR biyoreaktöründe zamanın bir fonksiyonu olarak kaydedilen (a) 25 μM AAZ ve (b) 10 μM MZA ile muamele edildi. Ligand tedavisinin zamanı bir okla gösterilir. Spektral yoğunluk (a.u.) maviden (en düşük) sarıya (en yüksek) kadar renk kodludur. Bu rakam Luchinat ve ark.25’in izniyle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: 1D NMR spektrumlarından temsili MCR-ALS çıkışı. (a) MCR-ALS tarafından yeniden yapılandırılan saf bileşenlerin 1H NMR spektrumları: Ligandların yokluğunda (siyah) ve AAZ (kırmızı) veya MZA (macenta) ile komplekste CAII (b) MCR-ALS tarafından elde edilen AAZ (kırmızı) veya MZA (macenta) ilavesi üzerine zamanın bir fonksiyonu olarak serbest (siyah) ve bağlı CA II’nin nispi konsantrasyon profilleri. Ligand tedavisi zamanları oklarla işaretlenir. Bu rakam Luchinat ve ark.25’in izniyle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: MCR-ALS tarafından yeniden yapılandırılan saf bileşenlerin 2D NMR spektrumlarından temsili MCR-ALS çıkışı. (a) MCR-ALS tarafından yeniden yapılandırılan saf bileşenlerin 1H-15N spektral bölgeleri (I-IV etiketli): disülfür indirgenmiş SOD1 (siyah) ve disülfür oksitlenmiş SOD1 (kırmızı); (b) MCR-ALS tarafından elde edilen ebselen (okla işaretlenmiş) ilavesi üzerine zamanın bir fonksiyonu olarak saf bileşenlerin nispi konsantrasyon profili. Bu rakam Luchinat ve ark.25’in izniyle çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Hücre içi NMR deneyi için bir biyoreaktör kullanmanın amacı, hücreleri uzun süre canlı ve metabolik olarak aktif tutmaktır. Bu amaca ulaşmak için bir dizi kritik husus dikkate alınmalıdır. İlk olarak, hücre numunesini hazırlarken ve NMR veri toplama sırasında bakteriyel kontaminasyondan kaçınmak çok önemlidir. Laboratuvarda gen klonlaması ve rekombinant protein ekspresyonu için yaygın olarak kullanılan E. coli veya diğer bakteri suşları kullanılırsa, numune hazırlama sırasında hücreleri kirletebilirler. Biyoreaktöre girdikten sonra, bakteriler taze büyüme ortamından yararlanarak hızla büyüyecek ve endotoksinlerin üretimi nedeniyle hücre ölümüne neden olacaktır. Bakteriyel kontaminasyon, yalnızca ileri bir aşamada, büyüme ortamını sarı ve bulanık hale getirdiğinde tespit edilir. Ayrıca, biyoreaktörün eksik temizlenmesi, pompanın veya borunun bakteri, maya veya yaygın küflerle kirlenmesine neden olabilir.

Deneyin başarısı için bir gereklilik, gaz kabarcığı oluşumunun önlenmesidir. NMR bobininin aktif hacmindeki agaroz iplikleri arasında sıkışıp kalan gaz kabarcıkları, _H2O sinyalinin eksik bastırılmasına ve spektral kalitenin ciddi şekilde kaybolmasına neden olan büyük manyetik alan homojensizliklerine neden olacaktır (Şekil 2d). Kabarcıklar, sistemde sıkışan havadan veya gaz halindeki _CO2 oluşumundan kaynaklanabilir. Birincisi, hücre örneğini yerleştirmeden önce sistemi ortamla yıkayarak kolayca önlenebilirken, ikincisinden kaçınmak için büyüme ortamındaki NaHCO3 konsantrasyonunun azaltılması ve _CO2 çözünürlüğündeki farklılıkları en aza indirmek için sistemin tüm parçalarının sabit bir sıcaklıkta tutulması önerilir. Hücresel aerobik metabolizma da gaz halindeki _CO2 oluşumuna neden olabilir ve bu da akış hızını artırarak önlenebilir.

Hücre canlılığı her çalıştırmadan sonra Trypan Blue Test ile kontrol edilmelidir. Bununla birlikte, bu metabolik aktivite hakkında fikir vermez. Biyoreaktör çalışması sırasında hücrelerin metabolik durumunun daha eksiksiz bir resmini elde etmek için, ATP üretimini zamanın bir fonksiyonu olarak değerlendirmek için ^31P NMR spektrumları ^{gerçekleştirilebilir23,25}. Bununla birlikte, bu ölçüm için genellikle ^1H NMR ile eşzamanlı kayda izin verebilecek özel bir prob gereklidir.

CA II durumunda, 1H spektrumunun olağandışı bir bölgesinde iyi çözülmüş muhabir sinyallerinin varlığı, basit ^1D NMR spektrumlarından analizi kolaylaştırır ve protein ekspresyonu sırasında izotop zenginleştirmesi gerektirmez. Genel olarak, diğer proteinler, 0 ila –¹ ppm arasındaki protein hidrofobik çekirdeğinin tipik bir örneği gibi, diğer bölgelerdeki spektral değişiklikleri izlemek için yararlı ^{olan 1H sinyallerine yol açabilir11}; Bununla birlikte, bu bölgeler ~ 10 kDa’dan daha büyük katlanmış proteinler için kalabalık olma eğilimindedir. Bu durumda, SOD1 için gösterildiği gibi, protein ekspresyonu sırasında eşit olarak 15N ile zenginleştirilmiş büyüme ortamı sağlayarak proteini 15N ile zenginleştirmek ve 2D ^1H-15N NMR spektrumlarındaki gerçek zamanlı değişiklikleri izlemek tercih edilir. 2B spektrumlar, MATLAB’da 2B diziler olarak içe aktarılır, 1B dizilere yeniden düzenlenir ve MCR-ALS analizinden önce istiflenir. İkinci yaklaşım genellikle tespit edilebilir sinyallere yol açan herhangi bir hücre içi proteine uygulanabilir ve tek kalıntı seviyesinde protein konformasyonel değişiklikleri hakkında bilgi sağlar. Prensip olarak, ikinci yaklaşım nD spektrumlarına ve diğer izotop etiketleme şemalarına genelleştirilebilir.

Farklı hücre tiplerine uygulama ile ilgili olarak, protokol farklı hücre hatlarına kolayca adapte edilmeli ve ilgilenilen proteinin doğrudan hücrelerde eksprese edilmesini gerektirmemelidir. Bu nedenle, hücre içi NMR’ye yönelik diğer yaklaşımlar, ilgili makromolekülün rekombinant olarak üretildiği veya sentezlendiği ve daha sonra elektroporasyon veya diğer dağıtım yöntemleriyle hücrelere yerleştirildiği bu protokolle birleştirilebilir1,9,38. Farklı hücre hatları veya numune hazırlama protokolleri ile çalışırken, agaroz konsantrasyonu, iplik kalınlığı ve agaroz ipliklerindeki son hücre yoğunluğu gibi parametrelerin ampirik olarak optimize edilmesi gerekebilir. Ayrıca, burada açıklanan protokolün uygulanabilirliği, agaroz kapsüllemesini tolere eden hücrelerle sınırlıdır. Diğer hücre tipleri farklı hidrojel formülasyonları gerektirebilirken, süspansiyonda doğal olarak büyüyen hücreleri analiz ederken farklı bir kurulum önerilir, örneğin, asılı hücreleri NMR tüpünde sınırlı tutarken besin difüzyonunu sağlamak için bir koaksiyel mikrodiyaliz zarı ^kullanmak23.

Diğer NMR biyoreaktör tasarımları19,20,21,22 ile karşılaştırıldığında, burada açıklanan cihaz, küçük değişikliklerle uyarlanmış^, ticari olarak temin edilebilen bir akış ünitesine dayanmaktadır. Bu nedenle, cihaz yüksek tekrarlanabilirliğe sahip farklı laboratuvarlarda kolayca çoğaltılabilir. Ayrıca, standartlaştırılmış çalışmaya ve gerekirse katı laboratuvar güvenliği yönetmeliklerine tam uyum sağlar. Genel olarak, biyoreaktörün esnekliği ve kullanım kolaylığı, daha önce bildirildiği gibi olanlara ek olarak, hem hücrelerde hem de in vitro NMR çözeltisinin diğer birçok uygulamasına izin ^{vermelidir23,25}. Sonunda, aynı biyoreaktör tasarımı, sferoidler veya organoidler gibi bir dokunun fizyolojik ortamına daha çok benzeyen örneklere uygulanabilir, ancak NMR spektrometresinde bu tür örnekleri canlı tutmak veya hatta büyümelerini sürdürmek için uygun iskeleler bulunması şartıyla.

Materials

Materials
Citric acid	Sigma-Aldrich	251275
D2O	Sigma-Aldrich	453366
DMEM, high glucose	Life Technologies	10313-021
DMEM, high glucose, powder	Sigma-Aldrich	D5648
FBS	Life Technologies	10270
HCl	Sigma-Aldrich	30721
L-glutamine (200 mM)	Life Technologies	25030
Low-gelling agarose, powder	Sigma-Aldrich	A4018
NaHCO3, powder	Carlo Erba	478537
PBS	Life Technologies	10010
Penicillin–streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122
NaOH, pellets	Sigma-Aldrich	30620
Trypan Blue solution (0.4% (wt/vol)	Sigma-Aldrich	T8154	Hazard statement(s): H350 may cause cancer.
Trypsin–EDTA (0.05% (wt/vol))	Life Technologies	25300-054
Equipment
Avance III Spectrometer equipped with a 5 mm CryoProbe	Bruker	n/a	All modern spectrometers and narrow-bore magnets equipped with 5 mm probes are compatible.
InsightMR flow unit	Bruker	n/a
P-920 pump module from ÄKTA FPLC	GE Healthcare	n/a	Any FPLC, HPLC peristaltic or syringe pump should be compatible with the flow unit.