Summary
本研究では、トランスジェニックチャネルロドプシン-2(ChR2)マウスの無傷マウス心臓の心調律を、マイクロLEDアレイによる局所光刺激と心外膜電位の同時光学マッピングを用いて制御する方法を報告する。
Abstract
心室頻脈性不整脈は、世界中の死亡率と罹患率の主な原因です。高エネルギー電気ショックを用いた電気除細動は、現在、生命を脅かす心室細動の唯一の治療法です。しかし、除細動は耐え難い痛み、組織の損傷、予後の悪化などの副作用をもたらす可能性があり、より穏やかな心調律管理戦略の開発に対する重要な医学的必要性を示しています。エネルギーを低減する電気的アプローチに加えて、心臓オプトジェネティクスは、光感受性膜イオンチャネルと光パルスを使用して心臓の活動に影響を与える強力なツールとして導入されました。本研究では、ランゲンドルフ灌流された無傷のマウス心臓の光刺激を成功させるための堅牢で有効な方法を、3 x 3アレイのマイクロ発光ダイオード(マイクロLED)を適用したマルチサイトペーシングに基づいて説明します。心外膜電圧波の同時光学マッピングにより、領域特異的刺激の効果を調査し、新たに誘発された心臓活動を現場で直接評価することができます。得られた結果は、除細動の有効性が心不整脈の間の光刺激のために選択されたパラメータに強く依存することを示している。心臓の照明領域が重要な役割を果たすことが実証されます 終了の成功と、 不整脈パターンを変更するための照明中の心臓活動の標的制御をどのように達成できるか。要約すると、この技術は、心調律のリアルタイムフィードバック制御に向かう途中で現場でのメカニズム操作を最適化する可能性を提供し、領域特異性に関して、非特異的な電気ショックアプリケーションの使用と比較して心臓系への潜在的な害を減らすための新しいアプローチを提供します。
Introduction
不整脈時の時空間ダイナミクスの初期の研究により、心細動時の複雑な電気パターンは、渦のような回転励起波によって駆動されることが明らかになりました1。この発見は、不整脈の根底にあるメカニズムについての新しい洞察を与え、心筋の多部位興奮に基づく新しい電気的終結療法の開発につながりました2,3,4。ただし、電界刺激を使用した治療は非局所的であり、筋肉組織を含む周囲のすべての興奮性細胞を神経支配し、細胞および組織の損傷、および耐え難い痛みを引き起こす可能性があります。電気療法とは対照的に、光遺伝学的アプローチは、心筋細胞の活動電位を高い空間的および時間的精度で誘発するための特異的で組織保護的な技術を提供します。したがって、光遺伝学的刺激は、心臓細動中のカオス的活性化パターンの最小限の侵襲的制御の可能性を秘めています。
遺伝子操作5,6,7を介して興奮性細胞に光感受性イオンチャネルロドプシン-2(ChR2)を導入することで、光刺激を使用して興奮性細胞の膜電位の脱分極が可能になりました。ニューロンネットワークの活性化、心臓活動の制御、視力および聴覚の回復、脊髄損傷の治療などを含むいくつかの医学的用途が開発されている8,9,10,11,12,13,14。心臓病学におけるChR2の応用は、そのミリ秒の応答時間15のために大きな可能性を秘めており、不整脈心ダイナミクスの標的制御に非常に適しています。
この研究では、トランスジェニックマウスモデルの無傷の心臓のマルチサイト光刺激が示されています。要約すると、トランスジェニックα-MHC-ChR2マウス株は、欧州共同体の第7次フレームワークプログラムFP7 / 2007-2013(HEALTH-F2-2009-241526)の範囲内で確立され、S.E.Lehnart教授によって親切に提供されました。一般に、α-MHCの制御下でCre-リコンビナーゼを発現するトランスジェニック成体雄C57/B6/Jは、雌の B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdトマト)Hye/Jと対になっていた。心臓STOPカセットは第2世代で欠失したため、子孫は安定したMHC-ChR2発現を示し、心臓感光性コロニーを維持するために使用されました。全ての実験は、36〜48週齢の両性の成体マウスを用いて行われた。照明は、シリコンベースのハウジングおよび短い光ガラスファイバが実装されていないことを除いて、16,17で説明したように製造された3×3マイクロLEDアレイを用いて達成される。心臓アプリケーションでの最初の使用法は18で発見されました。同様の製造技術に基づく線形マイクロLEDアレイが、心臓ペーシング19のための貫通プローブとして適用されている。マイクロLEDは、550μmピッチで3 x 3アレイに配置され、非常に小さな領域で高い空間分解能と高い放射電力の両方を提供します。著者らは、この研究で、新しい抗不整脈治療法を開発するための道を開く可能性のある、用途の広い局所多部位光刺激を示しています。
以下の実験プロトコルには、逆行性ランゲンドルフ灌流ex vivoが含まれ、そのためにカニューレ大動脈が灌流入口として機能します。加えられた灌流圧と心臓収縮のために、灌流液は大動脈から分岐する冠状動脈を通って流れています。提示された研究では、灌流液リザーバーを1 mの高さ(73.2 mmHgに相当)に上げることによって達成される定圧セットアップを使用して心臓を灌流し、2.633 ± 0.583 mL / minの流量になります。実験中、2種類のTyrode溶液が灌流液として使用されます。通常のTyrodeのソリューションは安定した洞調律をサポートしますが、Low-K + Tyrodeのソリューションはピナシジルと混合して、マウスの心臓に不整脈を誘発することができます。六角形のウォーターバスを使用することで、6つの異なる平面窓を通して心臓を観察することができ、屈折による歪みの少ない複数の光学部品の結合が可能になります。
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Protocol
すべての実験は、ドイツの法律、地域の規定、および欧州実験動物科学協会連盟(FELASA)の勧告に従って、動物福祉規則に厳密に従いました。動物実験の承認申請は、担当の動物福祉当局によって承認され、すべての実験は動物福祉担当者に報告されました。
1. 実験準備と材料
- 光学マッピングのセットアップ
メモ: オプティカルセットアップと電気セットアップを 図1に示します。光学および電気のセットアップで使用されるすべてのコンポーネントは、材料の表に詳細に記載されています。- LED1とLED2を使用して、不整脈の誘発とバックアップ除細動を行います。ChR26の励起波長のピークである475nm付近の波長λ青色の高出力LEDを選択してください。光スペクトルをさらに狭めるには、470 ± 20 nmのバンドパスフィルターを使用します。
注:データシート20によると、この作業では、LED1とLED2の典型的な放射束は3.9〜5.3Wです。 - 中心波長λ赤色=625nm、放射束700mWの光を放射する高出力赤色LED(図1のLED 3)で光学マッピング用の心外膜を照明します21。赤色光は628±20nmのバンドパスフィルターでフィルタリングされ、カットオフ波長λDM = 685nmのロングパスダイクロイックミラー(DM)で反射されます。
- カメラ対物レンズの前にλフィルターカム=775±70 nmの発光フィルターを使用して、心臓活動の蛍光発光のみを記録します。低照度用途に適した高速対物レンズを使用してください。
注:マウスの心臓の細動の頻度は20〜35Hzの範囲です。したがって、1〜2kHz以上の周波数で録画するのに十分な速度のカメラを使用してください。
- LED1とLED2を使用して、不整脈の誘発とバックアップ除細動を行います。ChR26の励起波長のピークである475nm付近の波長λ青色の高出力LEDを選択してください。光スペクトルをさらに狭めるには、470 ± 20 nmのバンドパスフィルターを使用します。
- マイクロLEDアレイ
注:ここで適用されるマイクロLEDアレイは、他の場所でさらに詳しく説明されているように、マイクロシステム処理を使用して実現されます16,17。- 厚さ5μmのポリイミド(PI)層を4インチのシリコン基板(片面研磨、厚さ525μm)にスピンコートします。
- このPI層を窒素雰囲気下で最高温度450°Cで硬化させる。最高温度を10分間一定に保ちます。
- 紫外(UV)リソグラフィーとスパッタを用いて画像反転フォトレジスト(PR)を成膜し、250nmの薄い白金層(Pt)を成膜します。
- このPtベースのメタライゼーションを厚くし、厚さ1μmの金(Au)層を電気めっきし、パターン化されたPRをマスキング層として使用します。
- 第2のPI層をスピンコーティングする前に、第1のPI層とAu電気メッキメタライゼーションを備えたウェーハを、PI層の表面を化学的に活性化する酸素プラズマにさらします。
- 2番目のPI層を450°Cで再度硬化させ、UVリソグラフィを適用してPR層をパターン化し、パターン化されたPRをマスキング層として使用して反応性イオンエッチング(RIE)により、マイクロLEDチップとインターフェースプリント回路基板(PCB)のアレイのコンタクトパッドを開きます。
注意: このRIEプロセスステップでは、コンタクトパッドの開口部と2次元(2D)マイクロLEDアレイの外形を定義するために、それぞれ200Wと100Wを10分と30分間適用することをお勧めします。 - 溶剤とプラズマエッチングを使用してPRを剥がします。さらに厚さ6μmの金層を電気めっきして、コンタクトパッドをさらに厚くします。
- フリップチップボンダーを使用して、マイクロLEDチップをコンタクトパッドに取り付けます。
- 酸素プラズマでPI表面を活性化し、マイクロLEDチップを無溶剤接着剤でアンダーフィルします。その後、接着剤を120°Cで12時間硬化させます。
- マイクロLEDチップをカプセル化するには、アルゴンで別のプラズマ処理を行い、薄いフルオロポリマー層を手動で塗布します。この層を80°Cで1時間予備硬化します。
- マイクロLEDアレイを酸素プラズマにさらした後、最終的なカプセル化層としてシリコーンを手動で塗布し、下にあるフルオロポリマー層へのシリコン接着性を向上させるために使用されます。シリコーン層を80°Cと180°Cでそれぞれ1時間硬化させます。これらの最終硬化工程はまた、フルオロポリマー層を完全に硬化させる。
- PI基板のコンタクトパッドを、アレイを外部計測器に相互接続するためのストリップコネクタを備えたプリント回路基板にはんだ付けします。接着剤を使用してPCB上のはんだパッドを覆います。
- 電気設備
- 心電図(ECG)の記録に適した電極、例えば銀/塩化銀電極または単相活動電位(MAP)電極とECGアンプを使用して、心臓の電気的活動を継続的に監視します。さらに、適切なアクイジションデバイス(AD)を使用して、取得したすべての電気信号を記録します。
- 各デバイスに印加される最大電流を管理できる高出力LED(LED 1、LED 2、およびLED 3)に最適なドライバを選択してください。任意関数発生器(AFG)を使用して、LEDドライバの出力を正確に制御します。
- マルチチャネルLEDドライバを使用して、マイクロLEDアレイを流れる電流を制御します。複数の出力を持つAFGもこのタスクに適しています。
注意: 電流をマイクロLEDの最大電流に制限するLEDドライバを選択することをお勧めします, そうしないと、ダイオードが損傷する可能性があります.マルチチャネルマイクロLEDドライバの一例は、別の著作物18に記載されている。必要に応じて、AFGまたはその他のLEDドライバをコンピュータに接続して、マイクロLED設定をリモート制御することができます。この場合、LEDドライバを、汎用インタフェースバス(GPIB)やシリアル接続など、選択した通信プロトコルを使用してコンピュータに接続します。
2. 実験手順
- 溶液調製
- タイロード溶液の調製:130 mM NaCl、4 mM KCl、1 mM MgCl 2、24 mM NaHCO3、1.8 mM CaCl 2、1.2 mM KH2 PO 4、5.6 mM グルコース、0.1% BSA/アルブミン。
- Low-K+ タイロードの溶液を準備する: Low-K+ タイロードの溶液は、KClの半分の量しか添加されないことを除いて、通常のタイロードの溶液と同じ方法で作成されます(4 mM KClではなく2 mM)。
注:3時間続く実験の場合、通常2〜3 LのLow-K + Tyrod(光学マッピングが実行されている場合はさらにブレビスタチン(ステップ2.1.5)と混合されます)および1〜2Lの通常のTyradeで十分です。 - ピナシジルをLow-K + Thirodeの溶液に加えて、22に記載されているように不整脈誘発のプロセスを容易にし、100 mM濃度を取得します。.ピナシジルを取り扱うときは、保護実験用手袋を着用してください。.
- 通常のタイロード溶液で1 mLの50 μM DI-4-ANBDQPQを調製します。光退色を防ぐために染料を光から保護します。
- ブレビスタチンの10 mMストック溶液を作ります。光学マッピングのために、ブレビスタチンを100 mMピナシジル-チロード溶液(ステップ2.1.3)と混合して、5 μM溶液を得ます。ブレビスタチンを取り扱うときは、保護実験用手袋を着用してください。.
注意: 光学マッピングが始まるまで、染料とブレビスタチン溶液の両方を脇に置いておきます。
- ランゲンドルフ灌流
注:セットアップは、2つのTyrodeのソリューション用の2つのリザーバーで構成されています。それらは、三方コックを備えたチューブを介してバブルトラップに接続されています。心臓は後でルアーロックコネクタによってバブルトラップに取り付けられ、六角形の水浴に吊り下げられます。次に、水浴は、使用済みのTyrodeの溶液を収集するために廃棄物容器に接続されています。- すべての実験の前に、完全に脱塩された水ですべてのチューブを清掃してください。
- 実験を開始する前に、両方のTyrode溶液をカルボーゲン(5%CO2および95%O2)で室温で30分間通気します。タイロード溶液のpH値をNaOHで7.4に調整します。
- 各Tyrodeの溶液を対応するリザーバーに500 mL充填し、チューブまたはバブルトラップに閉じ込められた気泡が見られなくなるまで、灌流システムにTyrodeの溶液を流して、チューブとバブルトラップを脱気します。
- Carbogenを使用したリザーバーでの実験全体を通してTyrodeの溶液を通気し続け、灌流液のpHが後で灌流中に安定していることを確認します。
- 灌流システムを水ヒートポンプで37°Cに加熱します。防水加熱ケーブルなどの追加の発熱体を使用して、水浴内の灌流液温度を一定に保ちます。
注:実験中は、Tyrodeの貯水池が空になる前に補充することが重要です。そうしないと、気泡が心臓に入り、血管を詰まらせて虚血を引き起こす可能性があります。
- マウスの準備
- 心臓隔離手順の30分前に500 IEヘパリン0.1 mLを皮下注射します。.
- 6 cmのペトリ皿と2 mLのシリンジに氷冷したタイロード溶液を入れます。実体顕微鏡の下に置きます。
- 飽和イソフルラン環境でマウスの短時間麻酔を2分間行い、その後すぐに頸部脱臼を行います。.
注:十分な麻酔を確認するためには、負のつま先間反射のチェックが絶対に必要です。 - 胸を開き、他の場所23で説明されているように心臓を取り除き、氷のように冷たいTyrodeの溶液を入れた6cmのペトリ皿に入れます。温度低下により心臓の鼓動が減少します。
- 他の場所で詳述されているように、実体顕微鏡下で細かい準備を行います23.大動脈を鈍い針に取り付け、縫合材料で血管を固定します。
- 対照として、氷のように冷たいTyrodeの溶液を針を通して心臓に注入し、心臓がしっかりと取り付けられていることを確認します。このステップはまた、心臓から残りの血液を洗い流します。
- マウントされた心臓を灌流システムに移します。針をバブルトラップに接続している間、空気が心臓に入るのを防ぐために灌流液が流れていることを確認してください。心臓が水浴中のTyrodeの溶液で覆われていることを確認してください。手順 2.3.4、2.3.5、および 2.3.7 を 図 2 に示します。
- 数分以内に心臓が鼓動し始めることを確認してください。心臓を灌流設定に15〜20分間適応させてから、ピナシジルを含む低K + Tyrodeの溶液(ステップ2.1.3)に切り替えます 光学マッピングを実行する場合は、ピナシジルとブレビスタチンを含むlow-K + Tyrodeの溶液(ステップ2.1.5)に切り替えます。
- 不整脈誘導と光解動
- 良好な信号品質を確保するために、ECG電極の1つを心臓表面のできるだけ近くに配置します。2番目のECG電極をタイロードの溶液に吊り下げます。取得したECGが選択したADによって記録されていることを確認してください。
- マイクロLEDアレイを研究の対象領域、たとえば左心室に配置します。
- 灌流をピナシジルを含む低K + チロードに変更し、心臓を15〜30分間灌流します。.
- 不整脈を誘発するには、周波数f indが25〜35 Hz、パルス持続時間Windが2〜15 ms、光強度LIopt_indが2.8 mW mm-2の20〜50光パルスの列で、LED1とLED2で心臓を照らします。
- 不整脈が誘発されるまでこのプロセスを繰り返します。
注:不整脈は、信号の周波数と形態が通常の洞調律とは異なるため、ECG信号で簡単に識別できます。不整脈が次の5秒以内に終了した場合は、自己終了として分類し、新しい誘導の試みを開始します。 - 持続的な不整脈が視覚的に検出されたら、アレイの3つ、6つ、または9つのマイクロLEDを使用して、15 mAのパルス電流Iパルスで異なる幅Wdefおよび周波数fdefのパルスのバーストを適用し、光強度LIμLED = 33.31 ± 2.05 mW mm-2になります。
- 5回のマイクロLEDアレイベースの除細動試行後も不整脈が続く場合は、その試みを失敗として分類し、バックアップ除細動を開始します。
- バックアップ除細動には、マイクロLEDアレイに設定されているのと同じタイミングパラメータを使用して、LED1とLED2を使用します。
注:心臓は実験期間全体にわたって虚血性および代謝性ストレスにさらされるため、バックアップ除細動でも不整脈の終了の試みが失敗する可能性があります。これが起こるときはいつでも、灌流溶液を通常のタイロードの溶液に変更し、心臓を5〜10分間回復させます。ECGが洞調律に戻ったら、ステップ2.4.3のプロトコルをもう一度繰り返します。
- オプティカルマッピング
- ステップ2.1.5で調製したブレビスタチン溶液で心臓を灌流し、機械的脱役が発生するまで待ちます。.これは、心臓の鼓動が停止したときに達成されますが、ECG信号はまだ測定可能です。
注:ブレビスタチン溶液を上記の濃度に混合し、心臓をこの溶液で灌流し続けると、実験全体を通して電気的活動から切り離された心臓の機械的活動が維持されます。 - 1 mLの電圧色素DI-4-ANBDQPQ(ステップ2.1.4で調製)を、ランゲンドルフ灌流のバブルトラップのボーラスとして与えます。染料が心臓に均一に灌流されるまで5〜10分待ちます。
注意: 録音が行われていないときはいつでも赤色光を消して、染料の光退色を避けてください。録音の信号対雑音比が小さすぎる(集録した信号のノイズが多すぎる)場合は、手順2.1.4と2.5.2を繰り返します。 - カメラを心臓の表面に焦点を合わせ、LED 3をオンにして、1.27 mW mm-2 の光パワーを適用します。
- 実験室の照明を消して録音を開始します。取得した信号の周波数を記録されたECGの周波数と比較して、光信号が取得されていることを確認します。これにより、得られた光信号が純粋に心臓の電気的活動に関連していることが保証されます。
注:色素が発する蛍光は非常に一週間であるため、光学マッピングは暗い部屋で行われます。これにより、他の光源からの信号干渉が回避されます。
- ステップ2.1.5で調製したブレビスタチン溶液で心臓を灌流し、機械的脱役が発生するまで待ちます。.これは、心臓の鼓動が停止したときに達成されますが、ECG信号はまだ測定可能です。
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Representative Results
このプロトコルは、LED 1とLED 2(図1)によって生成された光刺激パルスを使用して、無傷のマウス心臓に心室性不整脈を誘導し、周波数f indは25 Hz〜35 Hz、パルス持続時間Windは2ミリ秒から10ミリ秒です。このような急速な光パルスの目的は、心臓のリズムを捉えることではなく、心臓活動のバランスを崩して不規則な電波を発生させ、不整脈を促進することです。電気刺激による誘導よりも光で不整脈を誘発することの利点は、ECGにアーチファクトが引き起こされないことであり、取得した信号を制限なく後分析し、急速なペーシング中の心臓の電気的応答を評価する可能性を提供し、この事実はまた、光除細動中の心臓の挙動を観察する可能性を提供する。これは、電気誘導法や除細動法では不可能です。それにもかかわらず、使用されるセットアップが、例えば、場所の制約のために、外部の高出力LEDの使用を許可しない場合、他の場所3、22、24に示すように、不整脈を誘発するために追加のペーシング電極を心臓に配置することができる。
細動が誘発されると、不整脈はそれが持続することを確実にするために少なくとも5秒間続かなければならず、その後、マイクロLEDベースの除細動の試みが開始される。基本的な周期の長さや支配的な周波数、振幅、形態などの心不整脈の主なパラメータは絶えず変化しており、最新の状態ではどの光除細動パラメータが最良の結果をもたらすかを予測することは不可能であるため、周波数、パルス幅の間に関係があるかどうかを理解することは非常に興味深いものでした。 光刺激の領域と終了率。そこで、周波数fdef、マイクロLEDの数、パルス持続時間Wdefの異なる一連の実験を行い、図3に示すように、N=11匹のマウスの成功率を抽出した。
1〜20ミリ秒のパルスがさまざまな成功率で除細動できることを実証できます(図3)。ステップ2.4.6で述べたように、光強度LIμLED はすべての光刺激パルスで一定に保たれ、9個に対する3個のマイクロLEDの成功率は著しく低いことから、提示された結果は、心臓を覆う面積、マイクロLEDの数、したがって適用される総放射束が除細動を達成するための重要な要素であることを示唆しています。アレイ上のすべてのマイクロLEDがランバート光源であり、組織へのおおよその距離がゼロになるように心臓の表面に直接配置されていることを考慮すると、単一のマイクロLEDを使用した場合の心臓の照明領域の放射照度輪郭は、AμLED = 0.059mm²に相当すると仮定できます。 フラット長方形LEDの25 にも示されているように。さらに, 一部の光子はマイクロLEDを端から横方向に離れる可能性がありますが, 総光強度に対するそれらの寄与は非常に小さいと考えられるため、その効果は無視できます.アレイの照射光を定量化するために、著者らは商用パワーメーターでマイクロLEDアレイからの放射束を測定し、 表1に示すように心臓に到達する光強度を計算しました。 表1 から、放射束は使用されるマイクロLEDの数とともに増加するが、前述の照明プロファイルの影響により、光強度は一定のままであることがわかります。
興味深いことに、除細動周波数fdef = 18Hzおよびfdef = 20HzでWdef = 20ms(図3d)の9個のLEDの成功率は比較的高いことも観察できます。誘発された不整脈の平均周波数が22.55 ± 4.03 Hzであることを考慮すると、この事実は、ChR2マウス心臓の場合、ペーシング周波数が不整脈周波数に近いほど成功率が有意に増加することを示している可能性があります。このことは、数値シミュレーション26においても示されている。しかし、複雑な不整脈の支配的な頻度は絶えず変化しているため、これは簡単に一般化することはできません。これを説明するために、図4は、fdef = 14Hzでの2つの異なる除細動の試みを示しています。 図4a)のECGセグメントの開始時に、ECG信号の形態に従って、心室細動(VF)が示されている。マイクロLED光刺激が始まると、細動はより秩序あるパターンに変わり、心室頻拍(VT)である可能性が高くなります。マイクロLEDアレイがオフになるたびに、元のカオスVF波が再び引き継ぎます。したがって、不整脈は終了しません。この例では、VFは指定されたパラメータで終了できませんが、妨害され、より規則的なパターン(VT)に変更できます。図 4bセグメント1は、光刺激が始まり、VFがセグメント2でVTに変わり、支配周波数が14Hzに低下するまで、24Hzの支配周波数がわずかに増加することを示しています。さらに、図4cは、図4aと同じfdefで終端できるVTを示していますが、Wdefは異なります。まず、マイクロLED光刺激が不整脈の形態を変化させ、最終的に19番目のパルスから1:1のペーシングキャプチャでそれを終了します。これらの結果は、光除細動パラメータ、例えばWdefが、時間の経過に伴う不整脈の形態変化に適応しなければならないことを示唆しているかもしれない。これらの結果につながる実験は、結果として生じる活動電位持続時間(APD)の変化のために、ブレビスタチンを使用せずに実施された27。したがって、これらのシリーズでは光学マッピングは実行されませんでした。
赤方偏移電位差色素を用いた光学マッピングのための別の一連の実験が行われた(ステップ2.1.4)。高速カメラによる光学マッピングにより、洞調律(図5)および複雑な頻脈性不整脈28の間に心臓の表面を伝播する励起波を観察することができます。電位差測定色素の分数変化は非常に小さいので、得られたビデオは数学的プログラミング言語を用いて後処理された。光信号の品質を向上させるための最初のステップは、標準偏差がσ = 1のガウス平滑化フィルターを適用し、続いてコーナー周波数fhigh = 0.1Hzおよびflow = 70Hzのバンドパスフィルターを適用することでノイズを除去することです。f高 の阻止帯域は、3Hz<からf洞<8Hzの間にある心臓の洞周波数とは関係のない信号のゆっくりとした変化を除去し、f低 の阻止帯域は、カメラによってキャプチャされる高周波ノイズを除去します。LED 1、LED 2、およびマイクロLEDアレイからの青色光放射の両方が、光学マッピングにおいてクロストークと非常に高い干渉信号を引き起こす可能性があることに注意することが重要です。さらに、ステップ1.2.3で述べたように、波長λフィルターカムを備えたカメラの前の非常に狭いバンドパスフィルター でさえ、青色光の影響をフィルタリングしないことが観察されました。これは、色素自体の励起応答によって部分的に引き起こされる可能性があります。したがって、光学マッピング用の光学系を選択するときは十分に注意してください。ビデオ分析の手段については、青色光が記録されたすべてのフレームを無視しなければならなかったため、多くの場合、別の研究29でも述べたように、光刺激中に心臓を視覚化することはできません。
図1:電気的および光学的セットアップの概略図。 (a)LED1およびLED2は、不整脈の誘発およびバックアップ除細動に使用される青色光源を提供する。LED3は、赤方偏移色素DI-4-ANBDQPQの励起光源として用いられる。赤色光は、ダイクロイックミラーDMによって心臓に向けられます。濃い赤で示されている発光光は、本文に記載されているように、発光フィルターを介して高速度カメラによって記録されます。LED 2およびECG電極は、簡単にするために示されていません。(b)記録されたECG信号の1つのセグメントを赤で示しています。濃い青は、細動を誘発するために使用された周波数f ind = 35HzおよびWind = 4msでのLED1およびLED2からの光パルスを示す。光刺激を終えた直後に、心室細動(VF)が観察され得る。水色(f def = 16 Hz、Wdef = 20 ms)で示されているマイクロLEDベースの光刺激は、不整脈を正常に終了させます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:心臓の準備 。 (a)無傷の心臓と周囲の臓器を示すマウスの開いた胸。(b)さらなる準備のために氷のように冷たいタイロードの溶液に浸された移植された心臓。(c)マウスの心臓が鈍い針に正しく取り付けられている。(d)タイロードの溶液に懸濁したマウスの心臓。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:実験的に抽出された成功率。N = 11の場合、異なるパルス幅Wdefおよび周波数fdefで3つ、6つ、および9つのLEDを使用した30のマイクロLEDベースの光刺激パルスの成功率。平均S.E.M.の標準誤差で示されたエラーバー この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:光刺激による心調律の操作 。 (a)終端性不整脈のECG記録のセグメント。(b)パネル aに示す心電図のスペクトログラム。セグメント(1)のパワースペクトル密度(PSD)は、24Hzの支配的な周波数を有する不整脈を示す。 セグメント(2)は、示されたパラメータを有する光刺激を示す。支配的な周波数が14Hzに低下することが観察できます。 セグメント (3)終了に失敗し、24Hzの支配的な周波数で不整脈行動に戻る。 (c)除細動の試みが成功したECG。(d)パネル cに表示される正常な終了のスペクトログラム。セグメント(1)は、23Hzの支配周波数を有する心室頻拍(VT)を示す。 セグメント(2)は、示された設定を用いた光刺激を示す。セグメント(3)は正常な終端を示し、基本周波数が3.5Hzの正常な正弦リズムと結果として生じる高調波につながります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:心臓全体の光学マッピング。 正常な洞調律における心臓の1回の拍動中の蛍光強度の変化が示されています。心臓は、右心室と左心室が見えるようにカメラに面して配置されました(RV、LV)。アスタリスクは、上部に表示されている活動電位が取得されたピクセルを示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| マイクロLEDの数 | 照射面積Aμled[mm2] | 放射束φ [mW] | 光強度 リチウム [mW mm-2] |
| 3 | 0.178 | 5.9 ± 0.47 | 33.11± 2.66 |
| 6 | 0.356 | 11.91± 0.84 | 33.42±2.37 |
| 9 | 0.535 | 17.85± 0.61 | 33.39±1.14 |
表1:マイクロLEDアレイの測定された放射束と対応する光強度。
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Discussion
心臓頻脈性不整脈の治療の成功は、心臓治療の鍵です。しかし、不整脈の開始、永続化、終了の根底にある生物物理学的メカニズムは完全には理解されていません。したがって、心臓研究は、不整脈のより穏やかな終了に向けて電気ショック療法を最適化し、それによって患者の生活の質を向上させることを目的としています28,29,30,31。低エネルギーの電気的アプローチは、重篤な副作用の大幅な減少を約束するが、それでも望ましくない筋肉の興奮を誘発する可能性がある。心臓オプトジェネティクスはこの制限を克服し、組織穏やかな終結技術だけでなく、無傷のマウス心臓および細胞培養における渦様励起波の不整脈特異的標的制御を調査するための柔軟なプラットフォームも提供できます32,33。
その動機を考慮して、堅牢な光刺激セットアップとプロトコルが設計および実装され、どちらも適応性の高い光学システムを提供し、3次元パノラマ光学マッピング研究に簡単に拡張できます34。
心不整脈は、光刺激のために選択されたパラメータ、例えば心臓の照明領域に応じて、異なる成功率で首尾よく終了することができることを示すことができる。提示された結果は、照射面を増加させると、22にも示されているように伝導ブロックによるカオス活性を消滅させる臨界数の心筋細胞を動員することを示唆している。この研究では、光除細動に必要なエネルギーはE = 10.69 ± 0.37 mJです(9つのマイクロLED、30パルス、パルス幅Wdef = 20msを使用)。これは、E 22 = 228.8 mJおよびE 24 = 153.6 mJで以前に報告された22,24よりも低く、それぞれより大きな領域22または心臓24全体が照らされた。それにもかかわらず、十分に区切られたパターン領域が10個の光除細動パルスで照らされ、E35 = 1.8 mJをもたらす35に示すアプローチと比較して、本研究における光除細動エネルギーは著しく高い。他の3つのアプローチとは対照的に、提示されたプロトコルでは90%を超える成功率に到達できませんでした。より高い光除細動エネルギーにもかかわらず性能が低下する理由の1つは、根底にある不整脈の複雑さが考慮されていないことかもしれません。心臓の小さな領域を照明し、同時に不整脈の時空間ダイナミクスを測定することで高い終結率を達成した35の結果については、心臓の現在の状態に応じて異なるパターンのマイクロLED照明で応答するフィードバック制御を考慮することで、提示されたアプローチをさらに改善することができます。 さらに、不整脈は現在の方法では常に終結できるわけではありませんが、光刺激中に内因性の複雑なダイナミクスが乱され、より秩序ある時間状態につながる可能性があることも示されました。36に示されるように、単型性(より秩序ある)および多型性(より秩序の少ない)不整脈に対処する場合、終了率は有意に異なる。したがって、より良い除細動率に向けた論理的なステップは、VFエピソード中の心臓のダイナミクスに影響を与え、不整脈をより複雑でないパターンに変え、別のパルスセットで終了し、このようにして2段階の光刺激アプローチを構築することです。
灌流プロトコルに関しては、最も重要なステップは、心臓の正しい抽出と準備、および光学マッピング光学系の正しい調整にあります。光学マッピングを伴うには、色素スペクトルの適切な選択、適切な励起光源、およびカメラ29用の適切に選択された光学フィルタが厳密に必要である。そうしないと、記録された光信号のノイズが大きすぎる可能性があり、色素励起を伴う光刺激のクロストークも含まれる可能性があります。したがって、その後の解析では、いくつかの分析フィルタと画像スムージングを使用した信号の後処理が必要になることが多く、その結果、悪化することがよくあります。
このプロトコルのもう1つの重要なステップは、マイクロLEDアレイの正確で正確な配置です。マイクロLEDアレイとドライバ間の相互接続リードは非常に薄く柔軟性があるため、各実験でアレイを心臓表面のほぼ同じ位置に配置することが困難な場合があります。位置決めを容易にし、マイクロLEDアレイの取得位置を固定するために、ホルダーが設計され、3Dで印刷され、アレイをマイクロマニピュレータに取り付けることができました。これにより、Tyrodeのソリューションでの配列の動きをより細かく制御できます。マイクロLEDアレイの相互接続リード用に選択した材料によっては、ホルダーを使用する必要がない場合があります。
その上、プロトコルのもう一つの重要なステップは、例えばピナシジル37のような不整脈促進薬の追加です。いくつかの化合物は心臓の生理学的反応を変化させることでよく知られているので、結果を分析および解釈する際にこれを考慮する必要があります。光学マッピングに関する限り、提案されたプロトコルは、機械的アンカプラーとしてブレビスタチンを使用する。これには、記録中にモーションアーチファクトを除去するという利点がありますが、APD27を延長することもできます。この欠点を克服するために、記録中のモーショントラッキングの分析方法は、38,39と考えることができる。このようにして、心臓の正常な生理学的状態が維持され、高品質の信号を得ることができます。
提示されたプロトコルはマルチサイト光除細動に使用できることが証明されましたが、それでもいくつかの制限があります。場合によっては、細動はマイクロLEDベースの光刺激によって終了できず、妨害されるだけで、周波数が変化することがわかっています。1つの仮説は、心臓の蛇行波は左心室からのみ移動し、心臓の他の部分で再生しているというものです。グローバルイルミネーション24などの他の方法と比較して、本方法は、心臓の被覆範囲が小さいため、より低い成功率を提供する。しかし、ハードウェアベースのスパイラルアクティビティの適切な認識方法があれば、終了成功率の向上は可能であると確信しています。
結論として、提示された光刺激システムは、心不整脈の複数のカーディオバージョンアプローチおよび操作研究のための強力な実験ツールを確立する。このシステムで学んだ知識は、臨床的に関連する大型動物モデルにおける新しい潜在的な(写真)除細動プロトコルを調査および評価するために使用されます。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言していません。
Acknowledgments
著者らは、実験中の優れた技術サポートに対して、マリオン・クンツェとティナ・アルトハウスに感謝したいと思います。この成果につながる研究は、欧州共同体の第7次枠組みプログラムFP7/2007-2013から助成金契約番号HEALTH-F2-2009-241526で資金提供を受けています。ドイツ心臓血管研究センター、DZHK e.V.(プロジェクトMD28)、パートナーサイトゲッティンゲン、ドイツ研究財団CRC 1002(プロジェクトC03)、マックスプランク協会からも支援を受けました。この研究の一部は、ドイツ研究財団(DFG、助成金番号EXC 1086)が資金提供するBrainLinks-BrainTools、クラスターオブエクセレンスによってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemical Components | |||
| Blebbistatin | TargetMol | T6038 | 10 mM stock solution |
| BSA/Albumin | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Carbogen | Westfalen | 50 l bottle | |
| DI-4-ANBDQPQ | AAT Bioquest | 21499 | Dye for Optical Mapping |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | C6H12O6 |
| Heparin | LEO Pharma | Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription | |
| Hydrochlorid Acid | Merck | 1.09057.1000 | HCl, 1 M stock solution |
| Isoflurane | CP Pharma | 1 ml/ml, available only on prescription | |
| Magnesium Chloride | Merck | 8.14733.0500 | MgCl2 |
| Monopotassium Phosphate | Sigma-Aldrich | 30407 | KH2PO4 |
| Pinacidil monohydrate | Sigma-Aldrich | P154-500mg | 10 mM stock solution |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | KCl |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | NaCl |
| Sodium Hydroxide | Merck | 1.09137.1000 | NaOH, 1 M stock solution |
| Electrical Setup | |||
| Biopac MP150 | Biopac Systems | MP150WSW | data acquisition and analysis system |
| Custom-built ECG, alternative ECG100C | Biopac Systems | ECG100C | Electrocardiogram Amplifier |
| Custom-built water bath heater using heating cable | RMS Heating System | HK-5,0-12 | Heating cable 120W |
| Hexagonal water bath | |||
| LED Driver Power supply | Thorlabs | KPS101 | 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube. |
| LEDD1B LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current |
| MAP, ECG Electrode | Hugo Sachs Elektronik | BS4 73-0200 | Mini-ECG Electrode for isoalted hearts |
| micro-LED Driver e.g. AFG | Agilent Instruments | A-2230 | Arbitrary function generator (AFG) |
| Signal Generator | Agilent Instruments | A-2230 | AFG |
| micro-LED Array Components | |||
| Epoxid glue | Epoxy Technology | EPO-TEK 353ND | Two component epoxy |
| Fluoropolymer | Asahi Glass Co. Ltd. | Cytop 809M | Fluoropolymer with high transparency |
| Image reversal photoresist | Merck KGaA | AZ 5214E | Image Reversal Resist for High Resolution |
| LED chip | Cree Inc. | C460TR2227-S2100 | Blue micro-LED |
| Photoresist | Merck KGaA | AZ 9260 | Thick Positive Photoresists |
| Polyimide | UBE Industries Ltd. | U-Varnish S | Polyimide Solution |
| Silicone | NuSil Technology LLC | MED-6215 | Low viscosity silicone elastomer |
| Solvent free adhesive | John P. Kummer GmbH | Epo-Tek 301-2 | Epoxy resin with low viscosity |
| Optical Mapping | |||
| Blue Filter | Chroma Technology Corporation | ET470/40x | Blue excitation filter |
| Camera | Photometrics | Cascade 128+ | High performance EMCCD Camera |
| Camera Objective | Navitar | DO-5095 | Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras |
| Dichroic Mirror | Semrock | FF685-Di02-25x36 | 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter |
| Emmision Filter | Semrock | FF01-775/140-25 | 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter |
| Heatsink | Advanced Thermal Solutions | ATSEU-077A-C3-R0 | Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware |
| LED 1 and LED 2 | LED Engin Osram | LZ4-00B208 | High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA |
| LED 3 | Thorlabs | M625L3 | 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA |
| Lenses | LED Engin Osram | LLNF-2T06-H | LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM |
| Photodiode for power meter | Thorlabs | S120VC | Standard Photodiode Power Sensor |
| Power Meter | Thorlabs | PM100D | Compact Power and Energy Meter |
| Red Filter | Semrock | FF02-628/40-25 | BrightLine® single-band bandpass filter |
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