DNA-spændingssonder til at kortlægge immuncellernes forbigående piconewtonreceptorkræfter

Summary

Dette papir beskriver en detaljeret protokol til brug af DNA-baserede spændingsprober til at afbilde receptorkræfterne anvendt af immunceller. Denne tilgang kan kortlægge receptorkræfter >4,7 pN i realtid og kan integrere kræfter over tid.

Abstract

Mekaniske kræfter, der overføres ved krydset mellem to naboceller og ved krydset mellem celler og den ekstracellulære matrix, er kritiske for regulering af mange processer lige fra udvikling til immunologi. Derfor er det afgørende at udvikle værktøjerne til at studere disse kræfter på molekylær skala. Vores gruppe udviklede en række molekylære spændingssensorer til at kvantificere og visualisere de kræfter, der genereres af celler og overføres til specifikke ligander. Den mest følsomme klasse af molekylære spændingssensorer består af nukleinsyrestamme-loop hårnåle. Disse sensorer bruger fluorofor-quencherpar til at rapportere om den mekaniske forlængelse og udfoldning af DNA-hårnåle under kraft. En udfordring med DNA-hårnålespændingssensorer er, at de er reversible med hurtig hårnål, der foldes sammen igen efter afslutning af spændingen, og derfor er forbigående kræfter vanskelige at registrere. I denne artikel beskriver vi protokollerne til forberedelse af DNA-spændingssensorer, der kan “låses” og forhindres i at folde sammen igen for at muliggøre “lagring” af mekanisk information. Dette muliggør registrering af stærkt forbigående piconewtonkræfter, som efterfølgende kan “slettes” ved tilsætning af komplementære nukleinsyrer, der fjerner låsen. Denne evne til at skifte mellem spændingskortlægning i realtid og mekanisk informationslagring afslører svage, kortvarige og mindre rigelige kræfter, der almindeligvis anvendes af T-celler som en del af deres immunfunktioner.

Introduction

Immunceller forsvarer sig mod patogener og kræftceller ved kontinuerligt at kravle og scanne overfladerne af målceller for antigener og studse deres overflade ^1,2. Antigengenkendelse initieres ved binding mellem T-cellereceptoren (TCR) og peptid-major histokompatibilitetskomplekset MHC (pMHC) kompleks udtrykt på overfladen af målceller. Fordi TCR-pMHC-genkendelse sker ved krydset mellem to mobile celler, har det længe været mistænkt for at opleve mekaniske kræfter. Desuden førte dette til mekanosensormodellen for TCR-aktivering, hvilket tyder på, at TCR-kræfter bidrager til dens funktion ^3,4. For at forstå, hvornår, hvor og hvordan mekaniske kræfter bidrager til T-cellefunktionen, er det bydende nødvendigt at udvikle værktøjer til at visualisere de molekylære kræfter, der transmitteres af T-celler. Traditionelt bruges metoder som traction force mikroskopi (TFM) og micropillar arrays til at undersøge cellulære kræfter ^5,6. Imidlertid er kraftfølsomheden af TFM og mikrosøjle arrays på nanonewton (nN) skalaen og er derfor ofte utilstrækkelig til at studere de molekylære piconewton (pN) kræfter, der transmitteres af cellereceptorer⁷. For at forbedre kraften og den rumlige opløsning til detektion var vores laboratorium banebrydende for udviklingen af molekylære spændingsprober, som oprindeligt blev syntetiseret ved hjælp af polyethylenglycol (PEG) polymerer⁷. Molekylspændingssonder består af en udvidelig molekylær “fjeder” (PEG, protein, DNA) flankeret af en fluorofor og slukker og er forankret på en overflade. Kræfter, der påføres sondens endestation, fører til dens forlængelse, adskiller fluoroforen og slukkeren og genererer således et stærkt fluorescenssignal (figur 1A)^8,9,10.

I løbet af det sidste årti har vi udviklet et bibliotek af forskellige klasser af molekylære spændingsprober med fjederelementer fremstillet af nukleinsyrer¹¹, proteiner¹⁰ og polymerer⁸. Blandt disse giver de DNA-baserede spændingssonder det højeste signal / støjforhold og den største kraftfølsomhed, som let indstilles fra nogle få pN op til ~ 20 pN¹¹. Vi har brugt disse DNA-spændingssonder i realtid til at studere de molekylære kræfter, der genereres af mange forskellige celletyper, herunder fibroblaster, kræftceller, blodplader og immunceller^11,12,13. Dette manuskript vil beskrive protokoller til syntetisering og samling af DNA-spændingssonder på en overflade for at kortlægge molekylære receptorkræfter med pN-kraftopløsning ved hjælp af et konventionelt fluorescensmikroskop. Mens den nuværende procedure inkluderer kemiske modifikationer af nukleinsyren for at introducere den fluorescerende reporter (figur 1B), er det vigtigt at bemærke, at mange af modifikations- og oprensningstrinnene kan outsources til brugerdefinerede DNA-syntesevirksomheder. Derfor er DNA-spændingssondeteknologi let og tilgængelig for de bredere cellebiologi- og mekanobiologiske samfund.

Kort sagt, for at samle DNA-spændingssensorer, hybridiseres en DNA-hårnål til en fluorescerende ligandstreng på den ene arm og en slukningsankerstreng på den anden arm og immobiliseres derefter på et glassubstrat (figur 1C, realtidsspænding). I mangel af mekanisk kraft lukkes hårnålen, og fluorescensen slukkes således. Men når den påførte mekaniske kraft er større end F_1/2 (kraften ved ligevægt, der fører til en 50% sandsynlighed for udfoldelse), smelter hårnålen mekanisk, og der genereres et fluorescerende signal.

Med udgangspunkt i DNA-spændingssensoren i realtid beskriver vi også protokoller til kortlægning af akkumulerede kræfter, hvilket er særligt nyttigt til at studere interaktioner mellem receptorer på immunceller og deres naturlige ligand. Dette skyldes, at immunreceptorer ofte viser kortvarige bindinger ^3,14. Akkumulerede kræfter afbildes ved hjælp af en “låsende” streng, der fortrinsvis binder til åbne DNA-hårnåle og muliggør lagring af fluorescenssignaler forbundet med mekaniske trækhændelser (figur 1C, låst spænding). Låsestrengen er designet til at binde et kryptisk bindingssted, der eksponeres ved mekanisk induceret smeltning af hårnålen og låse hårnålen i åben tilstand ved at blokere hårnålens foldning igen, således at spændingssignalet lagres og genererer et akkumuleret spændingskort. Desuden er låsestrengen designet med et otte-nukleotid-tåhold, som muliggør en tåholdsmedieret strengforskydningsreaktion med sit fulde komplement, “oplåsningsstrengen”. Med tilføjelsen af oplåsningsstrengen fjernes den bundne låsestreng fra hårnålekonstruktionen, hvilket sletter det lagrede spændingssignal og nulstiller hårnålen tilbage til realtidstilstanden.

Figur 1: Skema for de nyeste molekylære spændingssonder. (A) Generelt design af molekylær spændingssonde i realtid, (B) strenge til den DNA-baserede spændingssondekonstruktion og (C) konstruerede DNA-baserede spændingssonder og deres skift mellem realtidstilstand og låst tilstand. Klik her for at se en større version af denne figur.

Hovedprotokollen består af fire hovedafsnit – oligonukleotidpræparation, overfladebehandling, billeddannelse og dataanalyse. Denne protokol er med succes blevet demonstreret af vores laboratorium og andre i naive og aktiverede OT-1 CD8 + T-celler, OT-II CD4 ⁺ celler samt hybridomer og kan anvendes til at forhøre forskellige immuncellereceptorer, herunder T-cellereceptor, programmeret celledødsreceptor (PD1) og lymfocytfunktionsassocieret antigen 1 (LFA-1) kræfter. OT-1 CD8⁺ naive T-celler bruges som eksempel på cellelinje i dette papir.

Protocol

OT-1 transgene mus er anbragt på Division of Animal Resources Facility ved Emory University. Alle forsøgene blev godkendt og udført under Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protokol. 1. Fremstilling af oligonukleotid Opløs ligandstreng-DNA’et i vand (18,2 MΩ resistivitet, anvendt gennem hele protokollen). Vortex og drej opløsningen ned med en bordpladecentrifuge. Indstil vandmængden, så den endelige koncentration er 1 mM. Koncentrationen valideres ved hjælp …

Representative Results

Her viser vi repræsentative overfladekvalitetskontrolbilleder (figur 4). En overflade af høj kvalitet skal have en ren baggrund i RICM-kanalen (figur 4B) og ensartet fluorescensintensitet i Cy3B-kanalen (figur 4C). Med det samme billeddannelsesudstyr og identiske betingelser for erhvervelse af fluorescensbilleddannelse bør baggrundsfluorescensintensiteten være konsistent og reproducerbar hver gang, når der udføres forsøg med …

Discussion

Med de detaljerede procedurer, der er angivet her, kan man forberede DNA-hårnålespændingssondesubstrater til at kortlægge og kvantificere receptorspændingen produceret af immunceller. Når celler belægges på DNA-hårnålespændingssondesubstratet, lander, fastgøres og spredes, når receptorerne registrerer liganderne både kemisk og mekanisk, hvoraf sidstnævnte detekteres af vores sonder. I nogle tilfælde kan celler dog ikke sprede sig (Figur 7A) eller undlader at frembringe spænd…

Materials

3-hydroxypicolinic acid (3-HPA)	Sigma	56197	maldi-TOF-MS matrix
mPEG-SC	Biochempeg	MF001023-2K	surface prep
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Acros	AC430941000	surface prep
10x Red blood cell lysis buffer	Biolegend	00-4333-57	buffer
8.8 nm gold nanoparticles, tannic acid	Nanocomposix	customized order	surface prep
Atto647N NHS ester	Sigma	18373-1MG-F	fluorophore, oligo prep
Attofluor Cell Chamber, for microscopy	Thermo Fisher Scientific	A7816	imaging
BD Syringes only with Luer-Lok	BD bioscience	309657	cells
biotinylated anti-mouse CD3e	ebioscience	13-0031-82	antibody/ligand
Biotinylated pMHC ovalbumin (SIINFEKL)	NIH Tetramer Core Facility at Emory University	NA	antibody/ligand
bovine serum albumin	Sigma	735078001	block non-specific interactions
Cell strainers	Biologix	15-1100	cells
Coverslip Mini-Rack, teflon	Thermo Fisher Scientific	C14784	surface prep
Cy3B NHS ester	GE Healthcare	PA63101	fluorophore, oligo prep
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Corning	21-031-CM	buffer
ethanol	Sigma	459836	surface prep
Hank’s balanced salts (HBSS)	Sigma	H8264	buffer
hydrogen peroxide	Sigma	H1009	surface prep
LA-PEG-SC	Biochempeg	HE039023-3.4K	surface prep
Midi MACS (LS) startup kit	Miltenyi Biotec	130-042-301	cells
mouse CD8+ T cell isolation kit	Miltenyi Biotec	130-104-075	cells
Nanosep MF centrifugal devices	Pall laboratory	ODM02C35	oligo prep
No. 2 round glass coverslips	VWR	48382-085	surface prep
NTA-SAM	Dojindo Molecular Technologies	N475-10	surface prep
P2 gel	Bio-rad	1504118	oligo prep
sufuric acid	EMD Millipore Corporation	SX1244-6	surface prep
Sulfo-NHS acetate	Thermo Fisher Scientific	26777	surface prep
Equipment
Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 column, 4.6 x 150 mm, 2.7 μm	653950-702		oligonucleotide preparation
Barnstead Nanopure water purifying system	Thermo Fisher		water
CFI Apo 100× NA 1.49 objective	Nikon		Microscopy
Cy5 cube	CHROMA		Microscopy
evolve electron multiplying charge coupled device (EMCCD)	Photometrics		Microscopy
High-performance liquid chromatography	Agilent 1100		oligonucleotide preparation
Intensilight epifluorescence source	Nikon		Microscopy
Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF-MS)	Voyager STR		oligonucleotide preparation
Nanodrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher		oligonucleotide preparation
Nikon Eclipse Ti inverted microscope	Nikon		Microscopy
Nikon Perfect Focus System	Nikon		Microscopy
NIS Elements software	Nikon		Microscopy
quad band TIRF 405/488/561/647 cube	CHROMA		Microscopy
RICM cube	CHROMA		Microscopy
TIRF launcher with 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW), and 640 nm	Coherent		Microscopy
TRITC cube	CHROMA		Microscopy
oligo name	5' modification / 3' modification	sequence (5' to 3')	Use
15mer amine locking strand	5' modification: no modification 3' modification: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	locking real-time tension signal
15mer Atto647N locking strand	5' modification: Atto647N 3' modification: /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	locking real-time tension signal
15mer non-fluoresccent locking strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	A AAA AAC ATT TAT AC	locking real-time tension signal for quantitative analysis
4.7 pN hairpin strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC CAGC	hairpin probe
amine ligand strand	5' modification: /5AmMC6/ 3' modification: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	hairpin probe
BHQ2 anchor strand	5' modification: /5ThiolMC6-D/ 3' modification: /3BHQ_2/	TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT	hairpin probe
Cy3B ligand strand	5' modification: Cy3B 3' modification: /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	hairpin probe
unlocking strand	5' modification: no modification 3' modification: no modification	TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C	unlocking accumulated tension signal